Odwrotna transkryptaza (rewertaza). „Szwajcarski nóż” armii wirusowej: tajemnica odwrotnej transkryptazy została rozwikłana Fragment charakteryzujący odwrotną transkryptazę

Rewertaza jest enzymem syntetyzującym cDNA na matrycy RNA.

W przypadku niektórych wirusów genom nie jest jak zwykle DNA, ale RNA. Takie wirusy nazwano retrowirusami (retro-rewers). W 1970 roku D. Baltimore i Kh.M. Temin odkryli mechanizm przenoszenia informacji z wirusowego RNA do DNA, tj. przeciwieństwo tego, co zachodzi w komórkach organizmów wyższych. Proces ten nazywa się odwrotną transkrypcją, a enzym, który go przeprowadza, nazywa się odwrotną transkryptazą lub rewertazą.

Odwrotna transkryptaza lub odwrotna transkryptaza [łac. transkrypcja- przepisywanie) - enzym polimeraza DNA zależna od RNA, za pomocą której przeprowadza się odwrotną transkrypcję - syntezę DNA na matrycy RNA; kodowane przez genomy niektórych wirusów RNA i ruchome elementy genetyczne genomu organizmów wyższych, ważne „narzędzie” inżynierii genetycznej. Odwrotna transkryptaza ma co najmniej trzy aktywności enzymatyczne:

1) polimeraza DNA, która wykorzystuje jako matrycę zarówno RNA, jak i DNA;

2) aktywność RNazy H, która hydrolizuje RNA jako część hybrydy RNA-DNA, ale nie jedno- lub dwuniciowy RNA oraz

3) Aktywność endonukleazy DNA.

Odkryty niezależnie przez D. Baltimore i H. Temin w 1970 r. w wirusach nowotworowych zawierających RNA (Nagroda Nobla za 1975 r. wspólnie z R. Dulbecco).

Zatem odwrotne transkryptazy są zdolne do syntezy DNA na matrycy RNA poprzez polimeryzację czterech trifosforanów dezoksyrybonukleozydów. I podobnie jak polimerazy DNA, działają tylko w obecności startera.

Odwrotne transkryptazy wykorzystywane są w syntezie dwuniciowego DNA, komplementarnego do RNA (zwłaszcza mRNA), w celu jego późniejszego klonowania w wektorach plazmidowych przy uzyskiwaniu bibliotek cDNA (clonoteks). Odwrotne transkryptazy, takie jak polimerazy DNA, można zastosować do wprowadzenia radioaktywnych lub etykieta fluorescencyjna do sond DNA zawierających odpowiednio znakowane trifosforany dezoksyrybonukleozydów.

Wykazano zdolność termostabilnej polimerazy DNA Thermus thermophilus do syntezy DNA na matrycy RNA w określonych warunkach. Dzięki temu można go stosować do bezpośredniego wykrywania specyficznych RNA w próbkach biologicznych metodą PCR. Nowoczesne modyfikacje tego podejścia umożliwiają w jednej mieszaninie reakcyjnej (i probówce) syntezę w reakcji odwrotnej transkrypcji niewielkiej liczby kopii zamplifikowanego fragmentu DNA na matrycy RNA, które są natychmiast wykorzystywane przez ten sam enzym, co matryca w konwencjonalnym PCR (PCR w jednej probówce).

Nazywa się to tak, ponieważ większość procesów transkrypcji w organizmach żywych zachodzi w przeciwnym kierunku, a mianowicie transkrypt RNA jest syntetyzowany z cząsteczki DNA.

Fabuła

Odwrotna transkryptaza została odkryta przez Howarda Temina na Uniwersytecie Wisconsin-Madison i niezależnie przez Davida Baltimore w 1970. Obaj badacze otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 1975 r. wspólnie z Renato Dulbecco.

Dokładność transkrypcji

Odwrotnej transkrypcji z RNA na DNA towarzyszy wysoki poziom błędy translacyjne, odróżnia to odwrotną transkryptazę od innych polimeraz DNA. Błędy te mogą prowadzić do mutacji odpowiedzialnych za lekooporność wirusów.

Znaczenie dla wirusów

Odwrotna transkrypcja jest wymagana w szczególności w cyklu życiowym retrowirusów, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności i ludzki chłoniak z komórek T typu 1 i 2. Po przedostaniu się wirusowego RNA do komórki, zawarta w cząsteczkach wirusa odwrotna transkryptaza syntetyzuje komplementarny do niego DNA, a następnie na tej nici DNA, niczym na matrixie, uzupełnia drugą nić.

Znaczenie dla eukariontów

Aplikacja

Terapii antyretrowirusowej

Rola w inżynierii genetycznej

W inżynierii genetycznej odwrotna transkryptaza służy do produkcji cDNA, kopii genu eukariotycznego, która nie zawiera intronów. W tym celu z organizmu izoluje się dojrzały mRNA (kodujący odpowiedni produkt genu: białko, RNA) i przeprowadza się na nim odwrotną transkrypcję jako matrycę. Powstały cDNA można przekształcić w komórki bakteryjne w celu wytworzenia produktu transgenicznego.

Zobacz też

Napisz recenzję o artykule "Odwrotna transkryptaza"

Notatki

Fragment charakteryzujący odwrotną transkryptazę

- O! O! O!
- Cóż, do widzenia, Bolkoński! Żegnaj, książę; „Przyjdź wcześniej na kolację” – słychać było głosy. - Opiekujemy się tobą.
„Kiedy rozmawiasz z cesarzem, staraj się w miarę możliwości chwalić porządek w dostarczaniu zaopatrzenia i tras” – powiedział Bilibin, eskortując Bolkońskiego do sali frontowej.
„I chciałbym pochwalić, ale nie mogę, o ile wiem” – odpowiedział Bolkonsky z uśmiechem.
- Cóż, ogólnie rzecz biorąc, rozmawiaj jak najwięcej. Jego pasją są odbiorcy; ale on sam nie lubi mówić i nie umie, jak się przekonacie.

Wychodząc, cesarz Franciszek tylko uważnie patrzył na twarz księcia Andrieja, który stał na wyznaczonym miejscu pomiędzy austriackimi oficerami i kiwał mu długą głową. Ale po opuszczeniu wczorajszego skrzydła adiutant grzecznie przekazał Bolkonskiemu, że cesarz pragnie udzielić mu audiencji.
Cesarz Franciszek przyjął go, stojąc na środku sali. Przed rozpoczęciem rozmowy księcia Andrieja uderzył fakt, że cesarz wydawał się zdezorientowany, nie wiedząc, co powiedzieć, i zarumienił się.
– Powiedz mi, kiedy zaczęła się bitwa? – zapytał pospiesznie.
Odpowiedział książę Andriej. Po tym pytaniu nastąpiły inne, równie proste: „Czy Kutuzow jest zdrowy? Jak dawno temu opuścił Krems? itd. Cesarz mówił z takim wyrazem twarzy, jak gdyby jego celem było jedynie zadanie określonej liczby pytań. Odpowiedzi na te pytania, choć zbyt oczywiste, nie mogły go zainteresować.
– O której godzinie rozpoczęła się bitwa? - zapytał cesarz.
„Nie potrafię powiedzieć Waszej Królewskiej Mości, o której godzinie rozpoczęła się bitwa od frontu, ale w Dürenstein, gdzie byłem, armia rozpoczęła atak o szóstej wieczorem” – powiedział Bolkonsky, ożywiając się i jednocześnie czas zakładając, że będzie w stanie przedstawić to, co już było w jego głowie, prawdziwy opis wszystkiego, co wiedział i widział.
Ale cesarz uśmiechnął się i przerwał mu:
- Ile mil?
- Skąd i dokąd, Wasza Wysokość?
– Z Durensteina do Kremsa?
- Trzy i pół mili, Wasza Wysokość.
-Czy Francuzi opuścili lewy brzeg?
„Jak relacjonowali harcerze, ostatni tej nocy przepłynęli na tratwach.
– Czy w Krems jest dość paszy?
– Pasza nie została dostarczona w takiej ilości…
Cesarz mu przerwał.
– O której godzinie zginął generał Schmit?…
- Myślę, że o siódmej.
- O 7:00. Bardzo smutny! Bardzo smutny!
Cesarz podziękował i skłonił się. Wyszedł książę Andriej i natychmiast został otoczony ze wszystkich stron przez dworzan. Ze wszystkich stron spoglądały na niego życzliwe oczy i słychać było delikatne słowa. Wczorajszy adiutant wyrzucił mu, że nie zatrzymał się w pałacu i zaproponował mu dom. Podszedł Minister Wojny, gratulując mu Orderu Marii Teresy III klasy, który nadał mu cesarz. Szambelan cesarzowej zaprosił go na spotkanie z Jej Królewską Mością. Arcyksiężna również chciała się z nim spotkać. Nie wiedział, komu odpowiedzieć, i przez kilka sekund zbierał myśli. Poseł rosyjski wziął go za ramię, zaprowadził do okna i zaczął z nim rozmawiać.
Wbrew słowom Bilibina, przyniesiona przez niego wiadomość została przyjęta z radością. Zaplanowano nabożeństwo dziękczynne. Kutuzow został odznaczony przez Marię Teresę Krzyżem Wielkim, a cała armia otrzymała odznaczenia. Bolkoński otrzymywał zaproszenia ze wszystkich stron i przez cały ranek musiał składać wizyty głównym dygnitarzom Austrii. Zakończywszy wizyty o piątej wieczorem, układając w myślach list do ojca o bitwie i podróży do Brunn, książę Andriej wrócił do domu, do Bilibina. Na werandzie domu zajmowanego przez Bilibina stała bryczka na wpół wypchana dobytkiem, a za drzwi wyszedł Franz, służący Bilibina, z trudem ciągnąc walizkę.

Odwrotna transkryptaza (odwrotnej lub zależnej od RNA polimerazy DNA) to enzym katalizujący syntezę DNA na matrycy RNA w procesie zwanym „ transkrypcja odwrotna". Nazwa procesu odzwierciedla przeciwieństwo procesu transkrypcje, prowadzone w przeciwnym kierunku: transkrypt RNA jest syntetyzowany z cząsteczki matrycy DNA.

Enzymy te wyizolowano z wirusów RNA ( retrowirusy). Odwrotna transkryptaza jest wykorzystywana przez wirusy nowotworowe do transkrypcji mRNA na komplementarną nić DNA. Badając retrowirusy, których genom jest reprezentowany przez jednoniciowe cząsteczki RNA, odkryto, że podczas rozwoju wewnątrzkomórkowego retrowirus przechodzi etap integracji swojego genomu w postaci dwuniciowego DNA z chromosomami gospodarza komórka. W 1964 roku Temin postawił hipotezę o istnieniu specyficznego dla wirusa enzymu zdolnego do syntezy komplementarnego DNA na matrycy RNA. Wysiłki mające na celu wyizolowanie takiego enzymu zakończyły się sukcesem i w 1970 roku Temin i Mizutani, a także niezależnie Baltimore odkryli pożądany enzym w preparacie zewnątrzkomórkowych wirionów wirusa mięsaka Rousa. Ta zależna od RNA polimeraza DNA nazywana jest odwrotną transkryptazą lub rewertazą.

Najbardziej szczegółowo zbadano rewertazę z ptasich retrowirusów. Każdy wirion zawiera około 50 cząsteczek tego enzymu. Odwrotna transkryptaza składa się z dwóch podjednostek - a (65 kDa) i b (95 kDa), występujących w ilościach równomolowych. Odwrotna transkryptaza ma co najmniej trzy aktywności enzymatyczne:

1) polimeraza DNA, która wykorzystuje jako matrycę zarówno RNA, jak i DNA;

2) aktywność RNazy H, która hydrolizuje RNA jako część hybrydy RNA-DNA;

3) Aktywność endonukleazy DNA.

Pierwsze dwie aktywności są wymagane do syntezy wirusowego DNA, a endonukleaza wydaje się być ważna dla integracji wirusowego DNA z genomem komórki gospodarza. Oczyszczona odwrotna transkryptaza syntetyzuje DNA zarówno na matrycach RNA, jak i DNA (ryc. 11).

Ryż. 11. Schemat syntezy dwuniciowych kopii DNA cząsteczek RNA

Aby rozpocząć syntezę, odwrotnataza, podobnie jak inne polimerazy, wymaga krótkiego regionu dwuniciowego (startera). Starterem może być jednoniciowy odcinek zarówno RNA, jak i DNA, który podczas reakcji zostaje kowalencyjnie połączony z nowo zsyntetyzowanym łańcuchem DNA. W inżynierii genetycznej stosuje się zarówno startery oligo-(dT), komplementarne do końców 3"-polyA mRNA, jak i zestaw heksanukleotydów „losowych” pod względem składu i sekwencji (losowe startery). Często dla cząsteczek RNA o znanej pierwotnej sekwencja, która nie ma końców 3"-poli(A), wykorzystuje chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy komplementarne do końca 3"

Odwrotna transkryptaza jest używana głównie do transkrypcji informacyjnego RNA na komplementarny DNA (cDNA). Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadza się w specjalnie dobranych warunkach przy użyciu silnych inhibitorów aktywności RNazy. W tym przypadku możliwe jest uzyskanie pełnej długości kopii DNA docelowych cząsteczek RNA. Po syntezie komplementarnej nici DNA na mRNA i zniszczeniu RNA (zwykle stosuje się obróbkę alkaliami), przeprowadza się syntezę drugiej nici DNA. W tym przypadku wykorzystuje się zdolność odwrotnej tazy do tworzenia samokomplementarnych spinek do włosów na 3-calowych końcach jednoniciowego cDNA, które mogą służyć jako starter.

Matrycą jest pierwsza nić cDNA. Reakcję tę może katalizować albo odwrotnaza, albo polimeraza DNA I E. coli. Wykazano, że połączenie tych dwóch enzymów umożliwia zwiększenie wydajności wytwarzania kompletnych dwuniciowych cząsteczek cDNA. Pod koniec syntezy pierwsza i druga nić cDNA pozostają kowalencyjnie połączone pętlą typu spinka do włosów, która służyła jako starter podczas syntezy drugiej nici. Pętla ta jest rozcinana przez endonukleazę S1, która specyficznie niszczy regiony jednoniciowe kwasy nukleinowe. Powstałe w tym przypadku końce nie zawsze są tępe i dla zwiększenia efektywności późniejszego klonowania naprawia się je do stępienia przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E. coli. Powstały dwuniciowy cDNA można następnie wprowadzić do wektorów do klonowania, namnażać jako część hybrydowych cząsteczek DNA i wykorzystywać do dalszych badań.

1) polimeraza DNA, która wykorzystuje jako matrycę zarówno RNA, jak i DNA;

2) aktywność RNazy H, która hydrolizuje RNA jako część hybrydy RNA-DNA;

3) Aktywność endonukleazy DNA.

Ryż. 11. Schemat syntezy dwuniciowych kopii DNA cząsteczek RNA

Matrycą jest pierwsza nić cDNA. Reakcję tę może katalizować albo odwrotnaza, albo polimeraza DNA I E. coli. Wykazano, że połączenie tych dwóch enzymów umożliwia zwiększenie wydajności wytwarzania kompletnych dwuniciowych cząsteczek cDNA. Pod koniec syntezy pierwsza i druga nić cDNA pozostają kowalencyjnie połączone pętlą typu spinka do włosów, która służyła jako starter podczas syntezy drugiej nici. Pętla ta jest rozcinana przez endonukleazę S1, która specyficznie niszczy jednoniciowe odcinki kwasów nukleinowych. Powstałe w tym przypadku końce nie zawsze są tępe i dla zwiększenia efektywności późniejszego klonowania naprawia się je do stępienia przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E. coli. Powstały dwuniciowy cDNA można następnie wprowadzić do wektorów do klonowania, namnażać jako część hybrydowych cząsteczek DNA i wykorzystywać do dalszych badań.