Бактериологический метод исследования. Выделение чистой культуры аэробных бактерий (1-2 этапы)
1. Суть бактериологического метода
3. Методы получения изолированных колоний
4. Методы получения чистой культуры
1. Провести первичный посев методом Коха и Дригальского
2. Выделить чистую культуру
План работы:
1. Бактериологический метод исследования
2. Этапы бактериологического метода
3. Понятие: чистая культура, штамм, колония
4. Методы получения изолированных колоний
5. Методы получения чистой культуры аэробных бактерий
Основным методом лабораторной диагностики инфекционных болезней является бактериологический метод. Суть бактериологического метода заключается в выделении возбудителей из исследуемого материала и его идентификации (определения рода, вида, разновидностей).
Бактериологический метод позволяет определить:
1. Вид возбудителя и поставить диагноз заболевания
2. Антибиотики, убивающие возбудителя и назначить соответствующее лечение
3. Фаговары и серовары возбудителя для выявления источника инфекции
Первый этап - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Первичный посев проводят на накопительные среды и ДДС (чашечные среды).
Второй этап - характеристика изолированных колоний и получение из них чистой культуры путем пересева на скошенный столбик основной среды.
Третий этап - идентификация чистой культуры - определение рода, вида, разновидностей возбудителя, определение антибиотикочувствительности, определение фаговаров.
Культура микроорганизмов - это бактерии, выросшие на питательных средах. Чистая культура - это бактерии одного вида, выросшие на питательных средах. Внутри вида встречаются разновидности, отличающиеся по одному признаку:
1. Морфовары - отличаются по морфологии
2. Хемовары - отличаются по биохимическим свойствам
3. Серовары - отличаются по антигенным свойствам
4. Фаговары - отличаются по чувствительности к фагам
Чистая культура необходима для проведения идентификации, определения сероваров, фаговаров, чувствительности к антибиотикам. Штамм - это бактерии одного вида, выделенные из конкретного источника (река Волга, больной Иванов и т. д.). Колония - видимое скопление бактерий одного вида, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.
Первый этап исследования - первичный посев исследуемого материала для получения изолированных колоний. Перед первичным посевом проводят микроскопию исследуемого материала. Исследуемый материал как правило содержит смесь различных бактерий, в том числе и возбудителей болезни. Для выделения возбудителя необходимо получить изолированные колонии (бактерии одного вида) путем подбора питательной среды и специальными методами посева.
Существует два метода получения изолированных колоний:
1. Метод Дригальского
Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.
Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).
Этапы метода:
1. Забор материала для исследования.
2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.
3. Заключение.
Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).
Выделение чистой культуры . Включает 3 или 4 этапа:
1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.
2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.
3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой
целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают
морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).
4(5). Идентификация чистой культуры.
Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.
Оценка метода:
достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам;недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.
21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным средам, классификация.
Требования:
среды должны быть питательными
должны иметь определенные ph
должны быть изотоническими, т.е. осмотическое давление в среде должго быть такое же как в клетке.
должны быть влажными и не слишком жидкими
должны облпдпть определенным окислительно-восстановительным потенциалом
должны быть стерильными
должны быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.
Питательные среды можно разделить:
А) По происхождению:
1} естественные - натуральные продукты питания (мясо, молоко, картофель);
2) искусственные - приготовленные специально для выращивания микробов: - среды из естественных продуктов (мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), - не имеющие постоянного состава; - синтетические питательные среды - растворы строго определенных количеств солей, аминокислот, азотистых оснований, витаминов в дистиллированной воде - имеют постоянный состав, используются для выращивания микроорганизмов и культур клеток при получении вакцин, иммунных сывороток и антибиотиков;
Б) По назначению:
1) общего назначения (МПБ, МПА) - на них растет большинство микробов;
2) элективные - избирательно способствуют росту одного вида микробов из смеси (например, желточно-солевой агар для стафилококков);
3) дифференциально-диагностические - позволяют отдифференцировать по внешнему виду среды один вид микроба от других (например среды Эндо, Левина для кишечной группы микробов).
Кроме того, в зависимости от целей использования в схеме выделения чистых культур, по назначению можно выделить следующие среды:
1) обогащения - подавляют рост микробов, сопутствующих возбудителю;
2) для получения изолированных колоний;
3) накопления чистой культуры;
В) По консистенции:
1) жидкие;
2) полужидкие (при добавлении агар-агара в концентрации 0,5-0,7%);
3) плотные - выше 1%.
26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.
Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования
Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.
В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.
При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.
Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.
При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий - элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.
При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.
В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.
На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.
Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.
Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.
Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.
Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам - третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.
Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.
С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.
Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат - антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.
Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.
Бактериологическое исследование - это исследование, предназначенное для выделения и изучения их свойств с целью постановки микробиологического диагноза.
Исследуемый материал следует брать в асептических условиях в стерильную посуду и доставлять в лабораторию возможно скорее. В случае необходимости пробы следует хранить на холоде. Методика взятия проб зависит от объекта, характера заболевания и свойств микроорганизма. Одним из распространенных приемов бактериологического исследования является бактериоскопия.
Для изучения нефиксированных бактерий пользуются двумя методами: раздавленной (между предметным и покровным стеклами) капли и . Следует помнить, что препараты нефиксированных бактерий заразны.
Для бактериоскопии фиксированных препаратов используют мазки. Для их приготовления каплю исследуемой жидкости распределяют по поверхности предметного стекла, а затем высушивают. Наиболее распространенным методом фиксации препарата является пронесение его через пламя газовой горелки. В некоторых случаях используют фиксирующие составы. Фиксированные препараты, как правило, окрашивают (см. Окраска микроорганизмов). К числу важнейших элементов бактериологического исследования относятся посевы и пересевы , производимые бактериальной петлей или пастеровской пипеткой. Петлю стерилизуют прокаливанием в пламени, затем ее остужают прикосновением к участку незасеянного агара или ополаскивая в стерильной жидкости. При использовании пастеровской пипетки ее кончик обламывают пинцетом, несколько раз проносят пипетку через пламя горелки и дают остыть. При посевах используют жидкие и твердые питательные среды. При посеве на скошенный агар культуру бактерий растирают петлей по поверхности агара. При посеве в толщу агарового или желатинового столбика питательную среду прокалывают до дна пробирки петлей или особой иглой. При посеве в жидкую среду надо следить, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала края пробирок и пробки. Посевы и пересевы следует проводить вблизи пламени газовой горелки, пробирки не должны долго оставаться открытыми, петля или пастеровская пипетка с культурой не должна ни к чему прикасаться; перед тем как закрывать пробирку, края ее следует прожечь. Засеянные пробирки необходимо тотчас же надписать.
Важнейшим этапом бактериологического исследования является идентификация - определение видовой или типовой принадлежности бактерий, полученных в виде чистой культуры. При идентификации бактерий производится изучение их физиологических и биохимических свойств, токсинообразования. Широко используют серологические методы идентификации бактерий (реакции и ). Во многих случаях эффективным оказывается биологический метод идентификации микроорганизмов, основанный на заражении лабораторных животных исследуемым материалом или полученной культурой бактерий и выявлении у животных характерных патологических изменений.
Для выделения чистых культур используют механические и биологические методы. Пример механического метода: каплю исследуемого материала растирают одним и тем же стерильным шпателем или бактериальной петлей по поверхности плотной питательной среды, последовательно в первой, второй и третьей . Выделение чистой культуры производится из выросших отдельных колоний и заключается в их исследовании и отсеве на свежую питательную среду. Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других микробов, находящихся в исследуемом материале.
При биологическом методе используют такого рода питательные среды, в которых созданы условия, благоприятные для развития определенного вида микробов. К числу биологических методов относится также заражение лабораторных животных, чувствительных к выделяемому виду бактерий.
Бактериологическое исследование - комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Бактериологические исследования пользуются также для обнаружения условно патогенных и санитарно-показательных микробов, характеризующих степень загрязнения внешней среды, для изучения микробного пейзажа определенной среды (объекта). Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для санитарно-гигиенической характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования.
Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания. При наличии бактериемии микроб обнаруживают при помощи посева крови. В случаях выраженных местных поражений возбудителя следует искать в отделяемом или выделениях пораженного органа (дифтерия, дизентерия, гонорея и др.). Наконец, при заболеваниях со сложным течением, когда (как, например, при брюшном тифе) бактериемия сменяется поражениями тонких кишок, на каждом этапе применяют соответствующий метод исследования: в течение первой недели заболевания производят посев крови, на второй наиболее достоверно серологическое исследование, начиная с третьей недели положительный результат получают при посеве испражнений; последним методом пользуются и в качестве контрольного исследования для обнаружения бактерионосителей среди реконвалесцентов и для наблюдения за ними.
Выполнение любой из указанных задач осуществляют применением методов, предназначенных для выделения и определения микроорганизмов. В зависимости от характеристики микроба используют весь комплекс методов или его части.
Бактериоскопия - наиболее достунный прием, основанный на микроскопическом изучении материала. При микроскопии свежих препаратов можно пользоваться некоторыми микрохимическими реакциями (например, окраска йодофильных бактерий раствором Люголя) или избирательной окраской разных структурных частей бактерий.
Более четко бактерии можно выявить в окрашенном препарате. Исследуемый материал наносят на предметное стекло тонким и по возможности ровным слоем. Дают препарату высохнуть на воздухе и фиксируют одним из общепринятых методов, но чаще всего фламбированием, т. е. двух-, трехкратным быстрым проведением препарата над пламенем горелки так, чтобы стекло было теплое, но не горячее. Препарат, остуженный после фиксации, окрашивают простой или дифференциальной окраской (см. Окраска микроорганизмов). При флюоресцентной микроскопии используют как нативные, так и сухие препараты. В этом случае обработка определенными красителями вызывает свечение структур микробного тела или всего микроба в ультрафиолетовых или коротких синих лучах. В другой модификации микробов обрабатывают специфическими сыворотками, меченными флюоресцентами (красителями). Бактерии, соответствующие сыворотке, будут светиться, так как на них осядет меченая сыворотка. Гетерологичные бактерии не будут светиться.
Методом бактериоскопии широко пользуются для бактериологической диагностики некоторых инфекционных заболеваний (гонорея, туберкулез, возвратный тиф), а также при изучении всего комплекса микрофлоры органа (миндалины, влагалище), продукта или другого объекта.
Метод посева, т. е. выделение чистой культуры искомого микроорганизма, является более точным и надежным способом бактериологической диагностики, чем бактериоскопия. Свежий материал размазывают по поверхности плотной питательной среды, налитой в чашки Петри. Первичный посев производят на обычные среды, благоприятные для данного микроба, на дифференциальные или на селективные среды. Выбор питательной среды (см.), как и метода предварительной обработки свежего материала для посева, зависит от степени его загрязнения сопутствующей посторонней микрофлорой. Через 24-48 час. содержания в термостате при оптимальной для данного микроба температуре чашки рассматривают и подозрительные колонии пересевают на среды, способствующие размножению данного возбудителя. Таким образом получают культуру однородных бактерий, которые и должны быть идентифицированы.
Идентификация микроба начинается с изучения его морфологии в окрашенном препарате и в раздавленной капле (см.) для определения формы микробов и их подвижности. Следующим этапом является исследование ферментативной способности бактерий по расщеплению углеводов, аминокислот, мочевины в определенных для каждого вида сочетаниях. У бактерий наиболее изучены сахаро- и протеолитические ферменты.
Идентификация микроба должна быть дополнена изучением других свойств, характерных для каждого рода и вида микроорганизмов. К таким свойствам относится способность выборочно растворять эритроциты разных животных (гемолиз), свертывать плазму крови (плазмокоагуляция), растворять сгусток фибрина (фибринолиз) и пр. Все эти особенности бактерий могут быть использованы при их определении как дифференциальные признаки.
Окончательное определение микробов некоторых видов, в основном патогенных бактерий семейства кишечных, включает серологическую идентификацию (см. Идентификация микробов). Обычно для этого ставят реакцию агглютинации, т. е. выявляют скучивание бактерий под влиянием одноименной иммунной сыворотки. Агглютинация микробов в сыворотке против определенного вида указывает на принадлежность к этому виду. Обычно реакцию агглютинации ставят ориентировочно на стекле и для окончательного определения в пробирках с разведениями сыворотки.
Ряд микробов не удается определить до конца описанным путем. Тогда идентификацию необходимо дополнить заражением лабораторных животных, поскольку для некоторых бактерий характерна патогенность или токсигенность, выявляющаяся при заражении животных. В некоторых случаях заражение животных служит также методом накопления патогенных микробов.
Только сопоставление всех характеристик культуры, собранных при изучении морфологии, биохимических, серологических, а где нужно и биологических свойств ее, может дать основания для идентификации. Ответ при положительном результате исследования не представляет затруднений, если выделенный микроб типичен. В таком случае указывают род, вид и, если определялся, тип бактерии. При выделении микроба, отклоняющегося по каким-то свойствам от типичной характеристики, дается ответ с указанием на отклоняющийся признак. В таком случае полезно повторить исследование, если позволяет течение болезни или условия сбора материала. Полезно также подвергнуть культуру атипичных микробов дополнительному изучению другими, более сложными методами.
Отрицательные результаты бактериологического исследования имеют относительное значение и показывают лишь, что в исследованной порции материала искомые микробы не содержались или были нежизнеспособны. Однако они могут присутствовать в другой порции. По этому, например, при обследовании на бациллоносительство (брюшной тиф, дизентерия, дифтерия) требуется проводить повторные исследования.
9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний
Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
морфология и тинкториальные свойства
культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)
серологические свойства (антигенные)
вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
патогенность для животных
фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
чувствительность к антибиотикам
другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 11. Схема изучения колоний
|
Возможные характеристики колоний |
||
|
Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
||
|
Величина, мм |
Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
|
|
Характер поверхности |
Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
|
|
Бесцветные, окрашенные |
||
|
Прозрачность |
Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
|
|
Характер краев |
Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
|
|
Внутренняя структура |
Гомогенная, зернистая, неоднородная |
|
|
Консистенция |
Вязкая, слизистая, крошковидная |
|
|
Эмульгирование в капле воды |
Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
