Обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) имеет ряд преимуществ перед другими вариантами жидкостной хроматографии:

– это очень гибкий метод, так как, изменяя состав водноорганических смесей, используемых в качестве подвижной фазы, можно на одной колонке обеспечить разделение соединений различной природы;

– селективность данного метода почти всегда значительно выше, чем других вариантов хроматографии для всех соединений, кроме сильнополярных

– при использовании гидрофобизированных силикагелей быстро устанавливается равновесие между подвижной и неподвижной фазой, эти сорбенты отличаются высокой эффективностью разделения;

– можно осуществлять разделение соединений, растворимых как в воде, так и в органических растворителях;

– возможность использования в подвижной фазе буферных растворов может улучшить селективность и эффективность разделения ионогенных соединений.

В обращенно-фазовой хроматографии неподвижной фазой служат гирдофобизированные силикагели, которые получают при обработке силикагеля хлор- и алкоксисиланом. Широко в аналитической практике используют гидрофобизированные силикагели с привитыми октадецильными группами (С18 ) Плотность прививки составляет 1,1- 2,3 нм-2 .

В зависимости от способа обработки свойства гидрофобизированных силикагелей могут изменяться, поэтому свойства коммерческих колонок различных фирм несколько отличаются. Содержание углерода составляет 5-20%. Степень покрытия поверхности силикагеля органическим модификатором составляет 10-60%, в лучших случаях она достигает 90%. Наличие остаточных силанольных групп приводит к тому, что

адсорбционный и ионообменный механизмы удерживания всегда сопутствуют обращенно-фазовому. Для уменьшения числа силанольных групп сорбенты дополнительно обрабатывают триметилхлорсиланом (это называют эндкеппингом). В табл. 12 представлены типичные обращеннофазовые сорбенты. Наиболее популярными являются силикагели следующих торговых марок: бондопак, лихросорб, порасил, сепарон, сферисорб, нуклеосил, кромасил. Недостатками обращенно-фазовых сорбентов на основе силикагеля являются ограниченно допустимый диапазон рН и сорбционная активность силанольных групп. Этого недостатка в значительной степени лишены колонки нового поколения фирмы «Феноминекс», ее колонка Луна С18 обладает стабильностью в диапазоне значений рН 1,5-10.

Механизм разделения соединений в этом варианте хроматографии пока до конца неясен. Наиболее удачными и распространенными являются теория, использующая представления о параметрах растворимости Гильдебранта, и сольвофобная теория Хорвата-Меландера. По теории, основанной на параметрах растворимости Гильдебранта, удерживание определяется молекулярными взаимодействиями разделяемых веществ с подвижной и неподвижной фазой. Зависимость фактора емкости вещества от состава подвижной фазы описывается уравнением

lnk = Aφ2 + Bφ + C (12),

где φ – объемная доля органического компонента (модификатора) в подвижной фазе, А, В и С – константы.

Однако поведение соединений сложного строения с несколькими функциональными группами часто не удается описать данной зависимостью. Более адекватно закономерности удерживания сорбатов в ОФ ВЭЖХ описываются сольвофобной теорией. Хорвартом и Миландером впервые было показано, что водные элюенты, не содержащие

Таблица 12. Сорбенты для обращенно-фазовой ВЭЖХ

Sp , м2 /г

Форма частиц

частиц, мкм

Адсорбсил С8

Нерегулярная

Адсорбсил С18

Нерегулярная

Адсорбсфер С8

Сферическая

Адсорбсфер С18

Сферическая

Алтима С8

Сферическая

Алтима С18

Сферическая

АльфаБонд С8

Нерегулярная

АльфаБонд С18

Нерегулярная

М-Бондопак С18

Нерегулярная

М-Бондопак Фенил

Нерегулярная

Гиперсил С8

Сферическая

Гиперсил ОДС

Сферическая

Зорбакс С8

Сферическая

Зорбакс ОДС

Сферическая

Диасорб-130-С1

Нерегулярная

Диасфер 130-С8

Сферическая

Диасфер-130-С18Т

Сферическая

Лихросорб RP-2

Нерегулярная

Лихросорб RP 18

Сферическая

Сферическая

Сферическая

Нуклеосил С18

Сферическая

Партисил ОДС-3

Нерегулярная

Сепарон С18

Сферическая

Силасорб С2

Нерегулярная

Силасорб С8

Нерегулярная

Силасорб С18

Нерегулярная

Сферическая

Сферисорб С18

органических растворителей, могли быть использованы для разделения полярных биологических молекул на октадецилсиликагеле. Даже при отсутствии органического компонента в элюенте, взаимодействие между растворенным веществом и привитыми углеводородными радикалами

неподвижной фазы, являлось причиной удерживания растворенного вещества. Что позволило сделать вывод о том, что удерживание в обращено-фазовом варианте в основном определяется гидрофобными взаимодействиями.

Важнейшую роль в понимании механизма удерживания обращеннофазовой хроматографии сыграли работы Хорвата и его школы. Суть теории Хорвата заключается в следующем. Существует принципиальное различие между процессами сорбции на полярных поверхностях из относительно неполярных растворителей («нормально-фазовый режим») и сорбции из воды либо сильнополярных растворителей на неполярных поверхностях («обращенно-фазовый режим»). В первом случае, между молекулами сорбатов и неподвижных фаз образуются ассоциаты за счет кулоновских взаимодействий или водородных связей. Во втором случае, причиной ассоциации на поверхности являются так называемые сольвофобные взаимодействия в подвижной фазе. Для полярных подвижных фаз, в особенности содержащих воду, характерно сильное кулоновское взаимодействие и образование водородных связей между молекулами растворителей. Все молекулы в таких растворителях связаны довольно прочно межмолекулярными силами. Для того чтобы поместить в эту среду молекулу сорбата, необходимо образование «полости» между молекулами растворителя. Энергетические затраты на образование такой «полости» лишь частично покрываются за счет взаимодействия полярных групп в молекуле сорбата с полярными молекулами растворителя. В аналогичном положении по отношению к растворителю находятся и неполярные молекулы неподвижной фазы. С энергетической точки зрения более выгодно такое положение, когда поверхность раздела между полярной средой (растворителем) и неполярными фрагментами неподвижной фазы и молекул сорбата минимальна. Уменьшение этой поверхности и достигается при сорбции (рис. 15).

Рис. 15. К механизму обращенно-фазовой хроматографии: а - сорбат в растворе; б - сорбат на поверхности неподвижной фазы. Молекулы воды и органического растворителя обозначены светлыми и темными кружками соответственно.

Обращенно-фазовая хроматография широко применяется не только для разделения нейтральных соединений, но и ионогенных веществ. В принципе, и для таких соединений процесс сорбции описывается сольвофобной теорией. Однако сорбаты такого рода существуют в растворе и адсорбированном состоянии, как в виде нейтральных молекул, так и в виде ионов. Каждой из этих форм соответствует свое значение фактора удерживания. В зависимости от рН среды изменяются соотношение различных форм в растворе и факторы удерживания.

В качестве подвижной фазы обычно используют смеси растворителей, т.к. это позволяет улучшить селективность и эффективность разделения и уменьшить время необходимое для его проведения.

Меняя состав подвижной фазы в ОФЖХ, можно изменять удерживание в очень широких пределах. Почти для всех анализируемых соединений удерживание в некоторых чистых растворителях (метанол, тетрагидрофуран) пренебрежимо мало, а в чистой воде чрезвычайно велико. Поэтому, чтобы добиться приемлемого времени удерживания,

обычно необходимо использовать смеси воды с органическим растворителем – так называемым модификатором. Зависимость фактора удерживания вещества от состава подвижной фазы описывается уравнением

где C – концентрация органического

компонента (модификатора) в

подвижной фазе, b и p – константы.

При постоянных условиях хроматографирования удерживание различных сорбатов определяется следующими факторами:

– гидрофобностью сорбатов;

– дипольным моментом;

– объемом их молекул;

– поляризуемостью;

– уменьшением площади неполярной поверхности при сорбции.

При описании взаимосвязи удерживания и свойств сорбатов наиболее популярны уравнения, связывающие факторы удерживания, измеряемые в хроматографической системе, с коэффициентами распределения (чаще всего в системе октанол – вода). Для соединений близкой структуры наблюдается линейная зависимость между логарифмами коэффициентов

где Pi,j - коэффициент распределения вещества между водной и органической фазами.

Во многих случаях логарифм фактора удерживания линейно связан с

Самым распространенным дескриптором является число атомов углерода. Эти соотношения полезны как при подборе состава подвижной фазы

как при разделении, так и для идентификации компонентов смеси.

Для решения каждой конкретной задачи состав как подвижной, так и неподвижной фазы должен быть тщательно подобран с точки зрения как физических, так и химических свойств ее компонентов. Общая схема выбора варианта ВЭЖХ в зависимости от природы разделяемых веществ показана на рис. 16.

Система для проведения разделения методом ВЭЖХ состоит из нескольких блоков: насоса, дозатора, колонки, детектора и регистрирующего устройства.

Рассмотрим основные типы насосов, используемых в ВЭЖХ.

Шприцевые насосы. Вращение прецизионного синхронного двигателя преобразуется в перемещение поршня в цилиндре. При движении поршня подвижная фаза либо поступает в цилиндр, либо выдавливается из него. Преимущество данного типа насоса – практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы, недостаток – невозможность создания градиента с помощью одного насоса.

Пневмоусилительные насосы . Обеспечивают постоянное давление на входе в колонку. Преимущества – отсутствие пульсаций потока, высокая надежность; недостаток – невысокая воспроизводимость объемной подачи подвижной фазы.

Плунжерные возвратно-поступательные насосы. С помощью электромеханического устройства приводится в возвратно-поступательное движение плунжер, перемещающийся в рабочей головке, в результате чего насос либо набирает подвижную фазу, либо подает ее с заданной скоростью. Преимущество – постоянная объемная подача подвижной фазы, недостаток – довольно большие пульсации потока, которые являются основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности детектора.

Рис. 16. Выбор условий ВЭЖХ с учетом гидрофобности разделяемых веществ

Для ввода пробы в жидкостной хроматографии используют следующие типы дозаторов:

– дозирующая петля

– дозаторы с мембраной (без остановки потока и с остановкой

Основные виды детекторов и их характеристики приведены в табл. 13. Наиболее распространенным детектором в адсорбционной ВЭЖХ является спектрофотометрический . В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны, соответствующей максимуму поглощения определяемых веществ. Такие детекторы измеряют поглощение света в ультрафиолетовой или видимой области спектра, причем первый вариант используется чаще. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно интенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200-360 нм. Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность. Чувствительность УФ-детектора может достигать 0,001 ед. оптической плотности на шкалу при 1% шума. При такой высокой чувствительности может быть зафиксировано до нескольких нг даже слабо поглощающих УФ веществ. Широкая область линейности детектора позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты смеси на одной хроматограмме. Возможности спектрофотометрического детектора существенно расширились после появления его современного аналога – детектора на диодной матрице (ДДМ), работающего как в УФ-, так и видимой области. В таком детекторе «матрица» фотодиодов (их более 200) постоянно регистрирует поглощение электромагнитного излучения в режиме сканирования. Это позволяет снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через

ячейку детектора компонентов. По сравнению с детектированием на одной длине волны, сравнение спектров, полученных в процессе элюирования пика, позволяет идентифицировать разделяемые компоненты с гораздо большей степенью достоверности.

Принцип действия флуориметрического детектора основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в УФ-области спектра, длины волн флуоресцентного излучения превышают длины волн поглощенного света. Флуориметрические детекторы обладают очень высокой чувствительностью и селективностью. Наиболее важная область их применение детектирование ароматических полициклических углеводородов.

Амперометрический детектор применяют для определения органических соединений, которые могут быть окислены на поверхности твердого электрода. Аналитическим сигналом является величина тока окисления. В детекторе имеется по крайне мере два электрода – рабочий и электрод сравнения (хлоридсеребрянный или стальной), иногда устанавливают вспомогательный электрод, необходимый для подавления влияния омического падения напряжения в растворах низкой проводимости. Успех определения определяет выбор материала и потенциала рабочего электрода. В амперометрическом детекторе используют электроды из углеродных материалов, наиболее часто стеклоуглеродный, и металлические: платиновый, золотой, медный, никелевый. Потенциал рабочего электрода устанавливают в интервале 0 - +1,3 В. Можно проводить измерения либо при постоянном потенциале, либо импульсном режиме, когда задается трехступенчатая развертка потенциала, которая обеспечивает на разных стадиях – окисление вещества, очистку электрода и его регенерацию. Использование этого

детектора особенно важно при определении фенолов, фенольных соединений, гидразинов, биогенных аминов и некоторых аминокислот.

Кондуктометрический детектор используют для определения неорганических анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества.

Таблица 13. Детекторы для высокоэффективной жидкостной хроматографии, используемые в анализе объектов окружающей среды

Вид детектора

Измеряемый

Минимально

Селективность

параметр

определяемое

количество, г

Спектрофото-

Оптическая

10 -10

метрический

плотность

Флуориметри-

Интенсивность

10 -11

флуоресценции

Кондуктомет-

Электропровод-

10-9

рический

Амперометри-

Величину тока

10-11 - 10-9

Масс-спектро-

Величину

10 -12 – 10 -10

метрический

ионного тока

Исключительно информативным является масс-

спектрометрический детектор, который обладает высокой чувствительностью и селективностью. Основная проблема, затрудняющая использование этого детектора, проблема ввода потока элюента в массспектрометр. Развитие микроколоночной хроматографии позволяет

разработать системы прямого ввода потока элюента в ионный источник масс-спектрометра. Используют масс-спектрометры высокого разрешения

и достаточного быстродействия с химической ионизацией при

атмосферном давлении или ионизацией с применением электрораспыления. Последние модели масс-спектрометров для жидкостной хроматографии работают в диапазоне масс m/z от 20 до

4000 а.е.м. Масс-спектрометрический детектор предъявляет жесткие требования к чистоте растворителей, является дорогостоящим и сложным

в обращении.

3.1.2. Использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для решения экологических задач

Определение загрязнений воды и почвы. Высокоэффективная жидкостная хроматография активно используется для определения различных экотоксикантов в водах и почвах. Наиболее значимые задачи, решаемые ВЭЖХ в анализе вод и почвы – определение фенольных соединений, ПАУ и пестицидов. Так как ПДК этих экотоксикантов в водах и почвах очень низки, их определение обычно проводят после предварительного концентрирования или выделения. Для этого можно использовать жидкостную экстракцию, но более удобным и эффективным методом является сорбция или твердофазная экстракция.

Определение фенолов в сточных и природных водах. Весьма распространенными экотоксикантами являются фенол и его хлорпроизводные и нитропроизводные, гваякол, крезолы. Эти соединения образуются в процессе производственной деятельности человека, в частности, в целлюлозно-бумажном производстве. Возникает необходимость их определения в различных типах вод: природных,

водопроводной, производственных и сточных. Состав вод весьма сложен и может включать большое число фенольных соединений, которые образуются как на стадии загрязнения, так и в процессе очистки вод. Наиболее вероятными компонентами сточных вод являются фенол, гваякол, о-, м- и п-крезолы, моно-, ди-,три- и пентахлорфенолы, моно- и динитрофенолы. Для разделения и одновременного определения летучих и малолетучих фенолов весьма удачным является использование высокоэффективной жидкостной хроматографии на гидрофобизированном силикагеле. Эффективность и селективность разделения фенолов определяется составом подвижной фазы. Наиболее часто для разделения фенолов в ВЭЖХ используют смеси ацетонитрила или метанола с буферными растворами (ацетатными или фосфатными), успешное разделение фенолов различного состава может быть достигнуто, если в качестве водного компонента подвижной фазы используется вода, подкисленная уксусной, хлоруксусной или фосфорной кислотой. Время удерживания фенолов определяется их гидрофобностью и увеличивается с ее ростом. Для наиболее значимых фенолов, загрязнителей окружающей среды, удерживание растет в ряду: катехол < фенол < 4-нитрофенол < гваякол < п-крезол < 2,4-нитрофенол < 2-нитрофенол < 2-хлорфенол < 4- хлорфенол < 3-хлорфенол < 2,4-диметилфенол < 4-хлор-3-метилфенол < 2,4-дихлорфенол < 2,4,6- трихлорфенол < пентахлорфенол и зависит от состава подвижной фазы. Чем больше в ней содержание ацетонитрила или метанола, тем меньше удерживание. Для разделения столь сложной смеси фенольных соединений не удается подобрать подвижной фазы определенного состава. Необходимо либо использование градиентного элюирования, либо разные фенолы делят с использованием различных подвижных фаз.

Низкие ПДК фенольных соединений в водах требуют чувствительных методов детектирования или предварительного

концентрирования. Достаточно успешным является детектирование фенолов с использование ДДМ, предел обнаружения фенола при длине волны 260 нм в этом случае достигает 1 мг/л. Еще большей чувствительностью и селективностью к фенолу и его производным обладает амперометрический детектор. Его использование позволяет определять фенолы на уровне ПДК даже в природных водах. В природных водах ПДК для фенола составляет 0,001 мг/л, п-хлорфенола – 0,002 мг/л, 2,4-дихлорфенола – 0,004 мг/мл, 2,4,6 – трихлорфенола – 0,006 мг/л и пентахлорфенола – 0,01 мг/л. Амперометрическое детектирование основано на окислении фенолов на поверхности твердого электрода, в качестве которого обычно используют стеклоуглеродный электрод. Установлено, что максимальный сигнал регистрируется при потенциале стеклоуглеродного электрода – +1300 мВ относительно стального или +1100 мВ относительно хлоридсеребрянного электродов сравнения. Важным является использование в качестве компонента подвижной фазы фосфорной кислоты, в этом случае минимальны флуктуации базовой линии сигнала амперометрического детектора, что позволяет уменьшить величину минимальной определяемой концентрации, которая соответствует сигналу, равному удвоенной “ширине” базовой линии. В табл. 14. приведены примеры определения фенола в водах в различных условиях, на рис. 17 показана хроматограмма смеси, а на рис. 18 – 20 определение фенолов в водопроводной и сточной воде.

Определение пестицидов . В современном сельском хозяйстве широко применяются химические соединения, используемые для борьбы с вредными организмами, грибами, сорняками, так называемые пестициды. Наряду с несомненной пользой крупномасштабное производство и бесконтрольное применение пестицидов привело к существенному обострению экологической обстановки.

Таблица. 14. Примеры определения фенольных соединений в водах ВЭЖХ

Определяемые фенолы

Неподвижная фаза

Подвижная фаза

Детектор

сmin , мг/л

Катехол, фенол, 4-нитрофенол, 2-

Spherisorb C18 ,

Метанол (МеОН) – 1%

0,03 ─0,1(прямой

нитрофенол, п -крезол, 2,4-динитрофенол,

раствор уксусной

2,4-диметилфенол, 2-хлорфенол, 4-

кислоты градиентный

(0,65 ─ 1,0) 102

хлорфенол, 2,4-дихлорфенол, 2,4,6-

(предварительное

трихлорфенол, пентахлорфенол

25 ─ 100% МеОН

концентрирование

Hypersil Green C18

Ацетонитрил (АН) - 1%

(0,3 – 8,0) 102

раствор уксусной

(предварительное

кислоты; градиентный

концентрирование

Kromasil C18 , 5

30 ─ 100% АН

(2,5 – 27) 103

МеОН – Н2 О;

(0,04 – 0,3) 103

градиентный режим:

Фенол, 2-хлорфенол, 2,4-дихдорфенол, 2,4,6-

25 ─ 100% МеОН

трихлорфенол, пентахлорфенол

АН ─ 0,1% раствор H3 PO4

Фенол, гваякол, п -крезол, о -крезол,

АН ─ 0,1% раствор H3 PO4

Пирагаллол, 4-гидроксианилин, бензкатехол,

2- гидроксианилин, фенол, крезолы, моно-,

Силикагель С18 ,

МеОН ─ 0,1 М раствор

8 10-5 – 4 10-4

ди-, трихлорфенолы, моно-, динитрофенолы,

Na2 HPO4 ─ 50 нM

ячейками

пентахлорфенол

нитрилтрехуксусная

кислота ─ 0,03 M раствор

додецилсульфата натрия;

градиентный режим

Рис. 17. Хроматограмма смеси: 2 – фенол; 3 – гваякол; 4 – п -крезол; 5 – о -крезол; 6 – хлоркрезол; 7 – п -хлорфенол; 1 – системный пик.Колонка: (150х4,6) мм, Mightysil RP-18; Подвижная фаза:

ацетонитрил:вода:фосфорная кислота (20,0:79,9:0,1)%об

Рис. 18. Хроматограмма образца сточной воды целлюлозо-бумажного комбината: 1 – системный пик; 2 – 2,4,6-трихлорфенол; 5 – пентахлорфенол; 3,4,6 – неидентифицированные пики.

Колонка (150х4,6) мм Mightysil RP-18; Подвижная фаза:

ацетонитрил:вода:фосфорная кислота (70,0:29,9:0,1) %об. Скорость подачи подвижной фазы 0,7 мл/мин. Детектор амперометрический. Потенциал рабочего электрода 1300 мВ

Рис. 19. Хроматограмма водопроводной воды с добавкой фенолов (1 мкг/л) с предварительной ион-парной экстракцией: 1 – фенол; 2 – 4- нитрофенол; 3 – 2,4-динитрофенол; 4 – 2-хлорфенол; 5 – 2-нитрофенол; 6

– 2,6-диметилфенол; 7 – 2,4-диметилфенол; 8 – 2-метил-4,6- динитрофенол; 9 – 4-хлор-3-метилфенол; 10 – 2,4-дихлорфенол; 11- 2,4,6- триметилфенол; 12 – 2,4,6-трихлорфенол; 13 – пентахлорфенол. Колонка: стальная (250х4,6 мм), Spherisorb ODS-2, 5мкм; Подвижная фаза: метанол – 1% уксусная кислота, градиентный режим (метанол 25-100%); детектор спектрофотометрический, 280 нм (пентахлорфенол 302 нм)

Рис. 20. Хроматограмма образца водопроводной воды с добавками фенолов: 1 – фенол (0,1 мкг/л); 2 – 2-хлорфенол (0,1 мкг/л); 3 – 2,6- дихлорфенол (0,2 мкг/л); 4 – 2,4-дихлорфенол (0,2 мкг/л).

Фенолы концентрировали из 30 мл.

Колонка (150х4,6) мм Mightysil RP-18. Подвижная фаза:

ацетонитрил:вода:фосфорная кислота (70,0:29,9:0,1) %об. Скорость подачи подвижной фазы – 0,7 мл/мин. Детектор амперометрический; потенциал рабочего электрода – 1300 мВ

Так как пестициды попадают в организм людей, не имеющих профессионального контакта с ядохимикатами, главным образом, с пищей и водой необходима постоянно действующая система анализа качества сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и воды. При этом наибольший интерес представляют методы анализа, которые можно было бы использовать не только в научных исследованиях, но и при широкомасштабном серийном аналитическом контроле. Учитывая высокую токсичность пестицидов, для мониторинга необходимы специфические и очень чувствительные аналитические методы, позволяющие определять остатки пестицидов и их метаболитов на следовом уровне.

Хроматографические методы анализа обладают более высокой чувствительностью и позволяют различать родственные соединения и их метаболиты или продукты гидролиза. В последнее время для определения и разделения пестицидов все чаще используется ВЭЖХ. Метод наиболее удобен при анализе малолетучих или термически нестабильных пестицидов, которые не могут быть проанализированы с помощью газовой хроматографии.

Наиболее успешно ВЭЖХ используется для определения карбаматов, мочевин, гербицидов на основе феноксиуксусных кислот, триазинов и их метаболитов, бензимидозолов и некоторых других соединений.

Одними из наиболее популярных гербицидов являются триазины, большинство из которых являются производными s-триазина – шестичленного гетероцикла с симметрично расположенными атомами азота. Заместители располагаются в положении 2,4 и 6. Наиболее известными являются три триазина: пропазин, атразин и симазин, два последних включены в список приоритетных загрязнителей для стран ЕС. Максимально допустимая концентрация триазинов в питьевой воде установлена на уровне 100 нг/л. При анализе вод триазины обычно предварительно концентрируют, а затем разделяют ОФ ВЭЖХ. Неподвижной фазой служат гидрофобизированные силикагели, подвижной фазой – смеси ацетонитрила с водой или буферными растворами Детектируют триазины с помощью детектора с диодной матрицей, УФ-, амперометрического и масс-спектрометрического детекторов. Примеры определения триазинов ВЭЖХ в водах и почве приведены в табл. 15.

Таблица 15. Примеры определения пестицидов в водах и почве ВЭЖХ

Определяемые пестициды

Неподвижная фаза

Подвижная фаза

Детектор

Сmin , мг/л

Триазины: атразин, симазин, пропазин,

Ultracarb C18 ,

Ацетонитрил (АН) – 1мМ

предварительное

прометин, тетбутилазин, деэтилатразин,

фосфатный буферный

концентрирование

деизопропилатразин, гидроксиатразин

раствор, рН 7

(0,8-3,0)10-3 мг/кг

градиентный режим

15 – 70 % АН

Триазины: гидроксиатразин,

Hypersil C18

Ацетонитрил(АН) - 1мМ

амперомет

2.10-5 М

гидроксисимазин, гидроксидеэтилатразин

фосфатный буферный

рический

раствор, рН 6,5

градиентный режим

30 –100 % АН

Производные фенилмочевины:

Supelkosil C18 ,

АН– Н2 О

предварительное

Монурон, флуметирон, Диурон, сидурон,

градиентный режим

концентрирование

линурон, небурон

40 – 90 % АН

(2-4)10-3

(0,4-3)10-4

Сульфонилмочевины

Хлорсульфурон, метилсульфурон,

Ultraspher C18 ,

МеОН–Н2 О(рН 2,5),

предварительное

хлоримурон, тифенсульфурон

градиентный режим

концентрирование

Viospher C6 , 5 мкм

40 –70% МеОН

Циносульфурон, тифенсульфурон, метил-

LiСhrospher C18 ,

МеОН – 0,1% H3 PO4

0,01-0,05 мг/кг

сульфурон, сульфометурон, хлорсульфурон

Карбаматы: карбарил, профарм, метиокарб,

Supelkosil C18 ,

АН– Н2 О (55:45)

предварительное

промекарб, хлорпрофам, барбан

концентрирование

(0,3-8)10-3

7. Соли четвертичных аммониевых оснований: паракват, дикват, дифензокват,хлормекват хлорид, мепикват

8. Гербициды кислотного характера: дикамба, бентазон, беназолин, 2,4 Д, МЦПА (2-метил- 4-хлорфеноксиуксусная кислота)

9. Производные фосфоновой и аминокислот: глифосат, глуфосинат, биалофос

10. Смеси пестицидов различных классов Симазин, фенсульфотион, изопрокарб, фенобукарб, хлортилонил, этридиазол, мепронил, пронамид, мекрпром, бенсулид, изофенофос, тербутол

11. Симазин, дихлофос, тирам, 1,3-дихлопропен, фенобукарб, пропизамин, ипрофенфос, изопротиолан, хлортилонил, фенитротион, диазитион, изохатион, тиобенкарб, хлорнитрофен, азулан, ипродион, бенсулин

12. Беномил, 2,4-Д, дикамба, римсульфурон, хлорсульфурон, линурон, хлорсульфоксим, пропиконазол, дифеноконазол

(0,1–10)10-4

Силикагель С18 ,

АН с добавками NaCl,

4,4.10-4 мг/кг

MeOH – раствор

гидроксида

тетраметиламмония

LiChrosorb C18

MeOH – 0,01 M триэтил

предварительное

амин, рН 6,9

концентрирование

градиентный режим

(0,2–1,0)10-4

MeOH – 0,05 M NaH2 PO4 ,

Флуоресц.

0,2.10-4

Nova-Pak C18

AH - 0,05 M NaH2 PO4 ,

(0,3–1.0)10-4

LiChrosorb NH2

0,02 M бромид ТМА

Капиллярная

АН –Н2 О

предварительное

колонка LC

градиентный режим

концентрирование

Parkings C18 ,

(0,15–0,8)10-3

АН – 1мМ фосфатный

предварительное

буферный раствор, рН 6,

концентрирование

градиентный режим

(0,04–0,5)10-3

Diaspher C16 , 5 мкм

АН – 0,01 М фосфатный

буферный раствор, рН 4,2

Еще одной группой пестицидов, для которых использование ВЭЖХ более перспективно, чем капиллярная газовая хроматография, являются производные фенилмочевины. Наиболее известными из них являются линурон, монолинурон, пиразон, и сульфонилмочевины (хлорсульфурон, тифенсульфурон, римсульфурон, метилсульфурон и др.).

ВЭЖХ широко применяется и для разделения и определения карбаматов. Особое внимание обращают на определение карбарила, профарма, метиокарба. Условия разделения фенилмочевин, сульфонилмочевин и карбаматов близки к условиям разделения триазинов.

Круг используемых детекторов включает: детектор с диодной матрицей, УФ-, флуориметрический и масс-спектрометрический детекторы. Достаточно широко используют амперометричекий детектор. Этот детектор дает выигрыш в чувствительности по сравнению с УФ при определении производных карбамата и мочевины (алдикарба, карбарила, хлорпрофарма, диметоата, метиокарба) примерно в 10 раз. Некоторые примеры разделения сульфонилмочевин, фенилмочевин и карбаматов показаны в табл. 15 и на рис. 21.

Селективные гербициды – призводные феноксиуксусной кислоты (2,4-Д, дикамба, бентазон, трихлорпир и др), также предпочтительнее определять ВЭЖХ. Неподвижной фазой служат гидрофобные силикагели, подвижной фазой – смеси ацетонитрила или метанола с буферными растворами или водой с добавкой кислот. Выбор рН подвижной фазы особенно важен при анализе соединений кислотного характера, его значение выбирают ниже, чем рКа разделяемых соединений. Для повышения селективности разделения можно использовать также ионпарный вариант обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Рис. 21. Хроматограмма экстракта почвы с добавкой (10мкг/г) гербицидов, производных фенилмочевины: 1 – циносульфурон; 2 – тиофенсульфурон метил; 3 – метилсульфурон метил; 4 – сульфометурон метил; 5 – хлорсульфурон.

Колонка стальная (100х4,6 мм), силикагель С18 , 3 мкм. Подвижная фаза метанол – 0,1% раствор фосфорной кислоты (45:55). Детектор спектрофотометрический, 226 нм

Триэтиламин используют в качестве ион-парного реагента для увеличения удерживания дикамбы, бентазона, беназолина, 2,4-Д и МЦПА (2-метил-4-хлорфеноксиуксусной кислоты) на октадецилсиликагеле в нейтральной области pH. Таким образом определяют гербициды кислотного характера в питьевых и подземных водах (табл. 15). Детектирование проводят УФ-детектором, наиболее низкие пределы обнаружения получены для УФ-детектора с диодной матрицей.

Важной задачей является также разделения смесей, содержащих пестициды различных классов, так как в объектах окружающей среды они

гидрофобизированных силикагелях: полярные соединения элюируются уже при небольшом содержании ацетонитрила (20-30)% в подвижной фазе, более гидрофобные при большем содержании (до 70%), поэтому для разделения смесей используют градиентный режим элюирования. Примеры разделения смесей пестицидов приведены на рис. 22, 23.

Рис. 22. Хроматограмма воды с добавкой пестицидов (0,2 мг/л) после предварительного сорбционного концентрирования: 1 – дисизопропилатразин; 2 – метамитрон; 3 – хлордиазон; 4 – дисэтилатразин; 5 – кримидин; 6 – карбетамид; 7 – бромацил; 8 – симазин; 9 – цианазин; 10 – дисэтилтербутилазин; 11 – карбутилат; 12 – метабензтиазурон; 13 – хлортолурон; 14 - атразин; 15 – монолинурон; 16 – изопротурон; 17 – метазахлор; 18 – метапротрин; 19 – димефурон; 20 – себутилазин; 21 – пропазин; 22 – тетбутилазин; 23 – линурон; 24 – хлорхурон; 25 – прометрин; 26 – хлорпрофарм; 27 – тербутрин; 28 – метолахлор; 29 – пенцицурон; 30 – бифенокс; 31 – пердиметалин.

Колонка: LiChroCART (250x4 мм), Superspher 100 RP-18, 5 мкм; подвижная фаза ацетонитрил – 1 мМ ацетат аммония (градиентный режим - ацетонитрил 25–90 %). Детектор спектрофотометрический, 220 нм

Рис. 23. Хроматограмма разделения смеси пестицидов: 1-метаболит беномила (2 мкг/мл); 2 – ацетамиприд (4 мкг/мл); 3 – ленацил (10 мкг/мл); 4

– дикамба (4мкг/мл); 5 – хлорсульфурон (5 мкг/мл); 6 - тирам(5 мкг/мл); 7 – хлорсульфоксим (8 мкг/мл); 8 – пенконазол (5 мкг/мл); 9 – линурон (5 мкг/мл); 10 – флудиоксонил (5 мкг/мл); 11-пропиконазол (5 мкг/мл); 12 – дифеноконазол (5 мкг/мл).

Условия хроматографического определения: колонка Diaspher C16 (150x4,6) мм со средним размером частиц 5мкм; подвижная фаза ацетонитри-0,01 М фосфатный буферный раствор (рН 4,2) (40:60). Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектор спектрофотометрический (230 нм)

Разделение хлорорганических пестицидов с помощью ВЭЖХ еще только изучается. Отчасти это, по-видимому, объясняется отсутствием общедоступных селективных методов обнаружения после разделения их посредством обращенно-фазовой хроматографии. Предел обнаружения хлорорганических пестицидов (типа ДДТ) и эфиров феноксикарбоновых кислот по поглощению при 254 нм составляет 1-15 и 15 мкг соответственно.

Как метод анализа остатков фосфорорганических пестицидов ВЭЖХ не получила должного распространения. Эти соединения обнаруживают по поглощению при 254 нм, по ингибированию холинэстеразы и

полярографически. Показана применимость в ВЭЖХ фосфорчувствительных детекторов для селективного обнаружения фосфорорганических соединений.

Одним из важных вопросов, определяющим чувствительность определения пестицидов является способ детектирования. Для большинства исследований характерно использование спектрофотометрического способа, но его использование ограничено рядом факторов: не все соединения хорошо поглощают, разные соединения имеют разные спектры поглощения. Поэтому очень трудно подобрать соответствующую длину волны. В объектах окружающей среды могут быть другие соединения, в присутствии которых определение пестицидов будет затруднено.

В последнее время широко исследуются возможности электрохимического детектирования (ЭХД) в жидкостной хроматографии. Пытаясь повысить чувствительность определения хлорорганических пестицидов с помощью ВЭЖХ, Долан и Зибер сконструировали усовершенствованный вариант электролитического кондуктометрического детектора Коулсона (ЭКДК). Для этого детектора характерна высокая селективность определения хлорорганических соединений, его линейный диапазон соответствует изменению величины концентрации в пределах пяти порядков, а нижний предел обнаружения линдана составляет 5-50 нг. Применимость ЭКДК в аналитической системе была продемонстрирована на примере анализа необработанных экстрактов листьев салата и речной воды, содержащих альдрин и диэльдрин в концентрациях менее 10-4 %. Использование в данном случае УФ-детектора с длиной волны 254 или 220 нм не позволяет определить альдрин и диэльдрин.

Достигаемые с помощью вольтамперометрических детекторов пределы обнаружения, относительная простота устройства и приемлемая стоимость делают этот метод вполне пригодным для анализа следовых количеств органических веществ. При использовании ЭХД, работающего в

режиме восстановления, одной из существенных проблем является восстановление растворенного в элюенте кислорода, пик которого может мешать определению анализируемого вещества. Есть различные пути удаления растворенного кислорода, однако при столь низких определяемых концентрациях пестицидов не всегда удается избавиться от его следовых количеств. В связи с этим, если имеется возможность, определение пестицидов проводится в анодной области потенциалов.

В сочетании с методом ВЭЖХ наиболее часто применяется амперометрическое детектирование, при котором потенциал рабочего электрода поддерживается постоянным и возникающий при окислении или восстановлении электроактивных молекул ток измеряется как функция времени. Амперометрический детектор позволяет определять с высокой чувствительностью широкий круг пестицидов: тирам, триазины (симазин, атразин, цианазин, пропазин и анилазин), карбаматные пестициды (барбан, байгон, беномил, хлорпрофам, ландрин, мезурол, профам, севин, аминокарб, карбендазим, десмедифам), фенилмочевинные пестициды (метобромурона и линурона). Эти соединения с помощью амперометрического детектора определяют в водах, в большинстве случаев пределы обнаружения ниже, чем со спектрофотометрическим детектором. Например, предел обнаружения для аминокарба и карбендазима меньше 1 мкг/л, десмедифама и дихлорана меньше 5 мкг/л, метамитрона 10 нг/л, хлортолурона и изопротурона 20 нг/л.

Определение полициклических ароматических углеводородов

(ПАУ). Весьма часто для определения ПАУ в водах и почвах используют жидкостную хроматографию. При необходимости одновременного определения средне и малолетучих ароматических углеводородов обычно выбирают обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию.

Вследствие уникальных свойств и широкой доступности октадецилсиликагелевых (ОДС) обращенных фаз большинство исследований ПАУ выполнено на этих фазах. С уменьшением длины цепи, привитого углеводородного радикала, значения коэффициента емкости быстро снижаются, что существенно усложняет анализ многокомпонентных смесей ПАУ. Так, в идентичных условиях (состав подвижной фазы, расход элюента, температура, размеры колонки) время удерживания ПАУ на колонке с Нуклеосилом С18 примерно вдвое больше, чем на Нуклеосиле С8 . Считают, что молекулы ПАУ удерживаются на неполярной поверхности алкилсиликагеля за счет ван-дер-ваальсовых сил, причем прочность связи растет с увеличением длины боковой цепи.

Сорбенты с привитыми полярными группами также используются для разделения ПАУ. Радикалы алкил(арил)алканов, используемых для модификации поверхности сорбентов, содержат одну или несколько полярных групп (-NH2 ,-NO2 ,- OH, -CN и др.). Механизм удерживания ПАУ на сорбентах с привитыми полярными группами довольно сложен.

Учитывается взаимодействие между π – электронной системой компонентов пробы и различными структурами полярной поверхности. Незамещенные ПАУ элюируются в порядке возрастания молекулярной массы. На полярной фазе, содержащей аминогруппы, удерживание ПАУ растет с увеличением количества ароматических ядер в молекуле. В отличие от колонок с гидрофобными силикагелями, на полярных фазах присутствие алкильных групп в молекулах ПАУ незначительно влияет на порядок удерживания, что позволяет использовать указанные фазы для предварительного фракционирования при анализе сложных смесей ПАУ.

На практике чаще разделение ПАУ проводят на гидрофобных силикагелях, поскольку выше селективность разделения, лучше воспроизводимость результатов, а также наблюдается более длительный срок службы хроматографических колонок.

В варианте обращенно-фазовой хроматографии для разделения ПАУ чаще всего в качестве элюентов используют водно-спиртовые смеси (водаметанол) и водно-ацетонитрильные смеси. Относительные времена удерживания для индивидуальных ПАУ сильно отличаются, поэтому чаще используют градиентный режим элюирования.

Существует множество вариантов детектирования ПАУ: амперометрическое, флуоресцентное, ультрафиолетовое. Наиболее часто используется флуоресцентное детектирование ПАУ. ВЭЖХ в сочетании с флуоресцентным детектором является селективным и чувствительным методом определения ПАУ в природных образцах. Спектрофотометрический детектор в УФ и видимой области на диодной матрице полезен для количественного и качественного анализа ПАУ в почвенных образцах в нанограммном диапазоне, в то время как флуоресцентный детектор рекомендован для анализа ПАУ в водных образцах в пикограммной области.

Наивысшая чувствительность флуоресцентного детектора может быть получена только при оптимальных длинах волн возбуждения и флуоресценции индивидуальных ПАУ. Это возможно только при программировании этих длин волн во времени. После оптимизации всех индивидуальных параметров минимальный предел детектирования отдельных ПАУ в питьевой воде достигает уровня 0,5 пикограмм.

Широко распространенные методики ЕРА рекомендуют определять нафталин, аценафтилен, аценафтен и флуорен при помощи ультрафиолетового детектора и использовать флуоресцентный детектор для определения всех остальных ПАУ. На рис. 24 показано разделение смеси 16 приоритетных ПАУ.

Рис. 24. Хроматограмма стандартной смеси EPA полициклических ароматических углеводородов: 1 – нафталин; 2 – аценафтен; 3 – флуорен; 4 – фенантрен; 5 - антрацен; 6 – флуорантен; 7 – пирен; 8 – 3,4-дибенз- антрацен; 9 – хризен; 10 – 3,4-бензфлуорантен; 11 – 11,12-бензфлуорантет; 12 – 3,4-бензпирен; 13 – 1,2,5,6-дибензантраце и 1,12-бензперилен; 14 – 2,3-о -фениленпирен.

Колонка (150х4,6мм) Mightysil RP-18; подвижная фаза: (75:25)

ацетонитрил-вода: детектор ─ флуоресцентный, режим програмирования по длинам волн флуоресценции

Определение ПАУ в объектах окружающей среды, особенно в водах

и почвах, является важной проблемой практической аналитической химии.

В литературе много работ, посвященных определению ПАУ методом ВЭЖХ в водах и почвах. Данные этих работ обобщены соответственно в табл. 16 и 17.

Трудности при проведении определения ПАУ ВЭЖХ связаны с необходимостью предварительной очистки экстрактов и принципиальными сложностями идентификации родственных по

химической

структуре

изомерных

соединений.

Таблица 16. Определение ПАУ методом ВЭЖХ в водах

Определяемые ПАУ

Неподвижная фаза

Подвижная фаза

Детектор

Cmin , нг/л

Питьевая

Фл, Б(b)Ф, Б(k)Ф, Б(a)П,

Ацетонитрил: вода

Б(g,h,i)П, Инд(1,2,3-cd)П

(250х4,6) мм, 5мкм

Градиентный режим

Загрязненная

Ацетонитрил: вода

(100х8) мм, 5 мкм

Градиентный режим

Lichrospher РАН С-18

Ацетонитрил: вода

(125× 2) мм, 4 мкм

Градиентный режим

Поверхностные

Метанол: вода (85: 15) с

(250х4,6) мм, 5мкм

Spherisorb S5 РАН

Ацетонитрил: вода(80:20)

(150× 4,6) мм, 5 мкм

изократи-ческий режим

Фл, Б(b)Ф, Б(k)Ф, Б(a)П,

Метанол: вода (85: 15)

Б(g,h,i)П, Инд(1,2,3-cd)П

(165× 4,6) мм, 5 мкм

изократи-ческий режим

Поверхностные

Ацетонитрил: вода

(250х4,6) мм, 5мкм

Градиентный режим

Фл, П, Б(a)П

Ацетонитрил: вода

(150× 4) мм, 5 мкм)

Градиентный режим

Природная

Lichrospher 100 RP-18

Ацетонитрил: вода (80:20)

0,5 нг/л (Б(а)П)

(125× 4) мм,5 мкм

изократи-ческий режим

Фл, Б(b)Ф, Б(k)Ф, Б(a)П,

SpherisorbODS – 2

Ацетонитрил: вода (80:20)

~ 8 пг (Б(а)П)

Б(g,h,i)П, Инд(1,2,3-cd)П

(300× 4) мм,5 мкм

изократи-ческий режим

Городские

Hypersil Green PAH

Ацетонитрил: вода

(100× 4,6) мм, 5 мкм)

Градиентный режим

Примечания:Фл – флуоресцентный детектор; Амп – амперометрический детектор;

TCAA – трихлоруксусная кислота; i-PrOH – изопропанол; 16 ПАУ – 16 ПАУ из стандартной смеси ЕРА

Фл – флуорантен; П – пирен; Б(b)Ф – бенз(b)флуорантен; Б(k)Ф – бенз(k)флуорантен; Б(g,h,i) – бенз(g,h,i)перилен;

Инд(1,2,3-cd)П – индено(1,2,3-cd)пирен;

ПО – предел обнаружения

Таблица 17. Определение ПАУ методом ВЭЖХ в почвах

Тип почвы

Определяемые

Неподвижная

Подвижная

С min,

Осадочные

С18 ((250× 4,6)

Ацетонитрил:

отложения

Градиентный

Почвенные

С18 ((250× 4,6)

Ацетонитрил:

Б(k)Ф, Б(a)П,

Градиентный

Сильноза-

Ацетонитрил:

грязненные

вода (80:20)

ODS ((243× 4)

Изократичес-

кий режим

С18 ((250× 4,6)

Ацетонитрил:

грязненные

Градиентный

Осадочные

С18 ((250× 4,6)

Ацетонитрил:

отложения

Градиентный

При анализе образцов речных вод, поскольку они могут содержать примеси флуоресцирующих соединений, при относительных временах удерживания ПАУ предложено использование предварительного разделения фракций ПАУ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и последующий анализ отдельных фракций ПАУ методом обращеннофазовой ВЭЖХ с флуоресцентным детектором.

В почвах и сложных природных смесях ПАУ для определения специфических изомеров ПАУ бывает необходимо использовать нормально-фазовый метод ВЭЖХ. Этот метод обеспечивает отделение и концентрирование изомеров, которые сложно определить в общей

фракции ПАУ из-за низких концентраций или из-за относительно низкой чувствительности и селективности флуоресцентного детектирования. Описан метод разделения природного экстракта морских отложений на аминопропилсиликагеле. Эта предварительная стадия обеспечивает получение фракций, содержащих только изомерные ПАУ и алкилзамещенные изомеры. Фракции изомерных ПАУ анализируют методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуоресцентным детектором.

Таким образом, ВЭЖХ с использованием флуоресцентного и ультрафиолетового детекторов позволяет определять ПАУ в различных объектах. Успех анализа определяется, как условиями разделения и детектирования, так и грамотной подготовкой пробы к анализу.

Определение загрязнений воздуха. Для определения загрязнений в водухе ВЭЖХ используется реже, чем в воде и почве. Этот метод незаменим при определении в воздухе токсичных высокомолекулярных и высококипящих органических соединений: к ним относятся диоксины, пестициды, полихлобифенилы, ПАУ, фенолы, ароматические амины и имины, азарены (азотсодержащие гетероциклические углеводороды) и их метильные производные. Во всех случаях предварительно загрязняющие компоненты улавливают из воздуха в специальных концентрирующих трубках, и после экстракции из фазы адсорбента анализируют полученный раствор ВЭЖХ.

Наиболее важным является определение в воздухе ПАУ (ПДК для атмосферного воздуха составляет 10-6 мг/м3 , воздуха рабочей зоны – 1,5.10-4 мг/м3 ) , анализ концентрата проводят аналогично тому, как описано для вод и почвы. Много внимания уделяют также определению фенолов и крезолов. Эта задача важна для жилых помещений, так как строительные материалы, покрытия, мебель могут выделять фенолы. Их улавливают при прокачивании воздуха через щелочные растворы или на специальных

Введение

Глава 1. Существующие способы определения содержания пестицидов в анализируемых объектах (обзор литературы)

1.1. Пробоподготовка с использованием твердофазной экстракции 6

1.2. Методы качественной характеристики пестицидов 16

1.3. Количественный анализ пестицидов 20

Глава 2. Техника и условия эксперимента

2.1. Определение коэффициентов распределения пестицидов в системе гексан/ацетонитрил с использованием газожидкостной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 24

2.2. Определение степени извлечения пестицидов из модельныхводных растворов с использованием твердофазной экстракции 30

2.3. Определение линейно-логарифмических индексов удерживания и относительных оптических плотностей пестицидов в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 32

2.4. Количественная оценка содержания пестицидов в растительных объектах методами внешнего стандарта и стандартной добавки 34

2.5. Определение содержания пестицидов в реальных растительных объектах.39

Глава 3. Оценка степени извлечения пестицидов из модельных водных растворов в условиях твердофазной экстракции на основании их коэффициентов распределения в системе гексан/ацетонитрил и параметров гидрофобности

3.1. Особенности использования обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии при определении коэффициентов распределения пестицидов в системе гексан/ацетонитрил 42

3.2. Оценка параметров гидрофобности потенциальных фосфорорганических пестицидов по их индексам удерживания в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 48

3.3. Оценка связи степени извлечения пестицидов из водных растворов при проведении твердофазной экстракции с их коэффициентами в системах октанол/вода и гексан/ацетонитрил 59

Глава 4. Интерпретация результатов идентификации и количественного определения пестицидов в растительных объектах

4.1. Выбор оптимальных аналитических параметров для хроматографической характеристики пестицидов 63

4.2. Сравнение методов внешнего стандарта и стандартной добавки для оценки содержания пестицидов в растительных объектах 71

Список литературы 92

Приложения 105

Введение к работе

Широкое использование химических средств защиты растений ставит анализ пестицидов в сельскохозяйственной продукции и объектах окружающей среды в ряд приоритетных задач эколого-аналитического контроля . В связи с этим, а также с новыми требованиями, предъявляемыми Ростехрегулированием к методам контроля , возникает необходимость в совершенствовании старых и разработке новых методик определения микроколичеств пестицидов [с применением газожидкостной (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) - хроматографии], в которых бы сочетались простота процедуры определения с максимальной надежностью получаемых результатов. Успешному решению этой задачи могут помочь новые подходы в определении следовых количеств экотоксикантов.

Важнейшими этапами проведения анализа пестицидов являются: подготовка проб и заключительная интерпретация данных, включающая как качественную, так и количественную характеристику анализируемых соединений. Подготовка проб к анализу обычно состоит из экстракции, повторной экстракции и очистки на колонке. Твердофазная экстракция (ТФЭ) представляет собой альтернативный подход в ее проведении. Она сводит ряд вышеупомянутых процедур в одну, что позволяет экономить время и реактивы. Однако для оптимизации процесса ТФЭ требуется некоторая информация о целевых веществах, в частности, об их коэффициентах распределения в гетерофазных системах растворителей 1-октанол/вода (log Р) и гексан/ацетонитрил (К р). В справочной литературе по пестицидам наряду с другими физико-химическими характеристиками приведены значения log Р пестицидов . Тем не менее, проблема их определения до сих пор остается актуальной из-за существующих трудностей, возникающих в процессе определения. Главная из них -

образование медленно расслаивающихся эмульсий обоих растворителей друг в друге. Это отражается в низкой межлабораторной воспроизводимости величин log Р пестицидов . Поэтому представляется важной систематическая характеристика пестицидов различных химических групп, прежде всего их коэффициентами распределения в системах октанол/вода и гексан/ацетонитрил, а также индексами удерживания в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [ИУ (ВЭЖХ)]. Последние могут быть использованы не только для идентификации анализируемых соединений, но и для оценки их параметров гидрофобности. Расширение подобной базы данных физико-химических характеристик пестицидов и круга характеризуемых соединений поможет с одной стороны полноценному проведению пробоподготовки, с другой - их идентификации. Однако для однозначной и надежной качественной характеристики недостаточно одного из имеющихся параметров. Необходимо оценить информативность различных сочетаний аналитических параметров пестицидов, что позволит с максимальной надежностью решить проблему их идентификации.

Заключительной стадией анализа после пробоподготовки и качественной характеристики анализируемых соединений является количественная оценка их содержаний в исследуемых образцах. Существующие способы количественного хроматографического анализа пестицидов (абсолютная градуировка, метод внутреннего стандарта) нельзя назвать оптимальными. Метод абсолютной градуировки при наличии систематических погрешностей пробоподготовки (как правило, из-за потерь искомых веществ на разных стадиях) без введения поправочных коэффициентов приводит к заниженным результатам, а применение метода внутреннего стандарта ограничено поиском необходимого стандартного соединения и предварительной дополнительной, трудоемкой процедурой специальной подготовки проб для проведения определения.

6 Таким образом, целью настоящей работы являлись совершенствование существующих и разработка новых методик определения пестицидов в растительных объектах. Для решения этой задачи необходима оптимизация каждого из основных этапов анализа пестицидов. Предлагаемая оптимизация включает: использование ТФЭ на стадии пробоподготовки, а при заключительной интерпретации данных - выбор наиболее оптимального сочетания аналитических параметров для хроматографической идентификации пестицидов, а так же выбор и использование метода количественной их оценкой позволяющей минимизировать систематические погрешности определений.

Методы качественной характеристики пестицидов

Идентификацию пестицидов (как и любых других органических веществ) при проведении хроматографического анализа (ГЖХ и ВЭЖХ) часто осуществляют по параметрам удерживания [абсолютные и относительные времена удерживания, индексы удерживания (линейные, логарифмические, линейно-логарифмические )] на различных по полярности фазах (ГЖХ) или в различных режимах элюрования (ВЭЖХ). Проведение качественного анализа пестицидов по абсолютным временам осуществляют в строгого заданных условиях, на одном и том же приборе с использованием необходимых стандартных (эталонных) соединений. Менее зависимые от конкретных условий анализа являются относительные времена удерживания (времена удерживания относительно какого-либо стандартного вещества). Они обладают значительно большей воспроизводимостью в изотермических условиях разделения (ГЖХ) и изократическом режиме элюирования (ВЭЖХ). Их можно использовать для сравнения данных, полученных в разных стационарных режимах, на разных приборах, в разных лабораториях. Однако характер неподвижных фаз (ГЖХ), тип колонок и состав элюента (ВЭЖХ) должен оставаться при этом фиксированным. В качестве стандартного соединения рекомендуется выбирать соединение того же класса, что и определяемое. Если же определять параметры удерживания (индексы удерживания (ИУ)) относительно двух стандартов, причем один из которых имеет меньшее, а другой большее время удерживания, чем искомое соединение, то они будут характеризоваться еще большей межлабораторной воспроизводимостью, чем относительные времена удерживания. Индексы удерживания могут быть представлены в линейной, логарифмической и линейно-логарифмической форме. Индексы удерживания в логарифмической форме используют в изотермическом режиме (ГЖХ) или изократическом режиме элюирования (ВЭЖХ). В случае анализа сложных смесей в условиях программированного изменения температуры колонки (ГЖХ) применяют линейные индексы удерживания. Однако как показано в наилучшей формой представления параметров удерживания в этих условиях являются линейно-логарифмические индексы удерживания. Их преимущество заключается в высокой воспроизводимости как в режиме линейного программирования температуры, так и изотермическом режиме (ГЖХ), а так же при различных режимах элюирования (изократический, градиентный) подвижной фазы в ВЭЖХ . Индексы удерживания нашли применение не только в анализе пестицидов, но и других загрязняющих органических веществ . Однако использование хроматографических параметров удерживания связано с неоднозначностью оценок. Это обусловлено реальной возможностью их совпадения с параметрами удерживания коэкстрактивных веществ, обычно присутствующих в пробе (коэкстрактивные вещества - соединения извлекаемые из матрицы вместе с аналитом).

Другой способ идентификации веществ основан на применении селективных детекторов. Газохроматографический анализ пестицидов осуществляют при использовании трех селективных детекторов -термоионный и пламенно-фотометрический детекторы применяют в анализе азот-, фосфор-, серосодержащих соединений, а детектор электронного захвата - в анализе галогенсодержащих веществ. Использование альтернативных детекторов ограничено тем, что хотя некоторые иззарегистрированы с необходимой чувствительностью. Анализ пестицидов в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ проводят практически с одним селективным ультрафиолетовым (УФ) детектором, избирательность которого регулируется выбором фиксированных длин волн. Применение диодных матриц дает возможность регистрации поглощения на нескольких длинах волн, обеспечивая тем самым большую вероятность качественной характеристики пестицидов .

Одними из наиболее надежных путей идентификации экотоксикантов являются гибридные методы, основанные на хроматогафическом разделении анализируемых веществ и последующей идентификацией с использованием спектральных (масс-, инфракрасных-, атомно-эмиссионных) детекторов . В этом случае, помимо хроматограмм с определяемыми параметрами удерживания, регистрируют соответствующие (масс-, инфракрасные-, атомно-эмиссионные) спектры соединений. Тем не менее, как отмечено в , «ни один из известных аналитических методов не может гарантировать надежную идентификацию любых соединений». К этому следует добавить, что использование гибридных методов ограничено дорогостоящим аппаратурным оснащением.Достоинства и ограничения каждого из используемых методов качественной характеристики пестицидов иллюстрирует таблица 1.2.

Определение линейно-логарифмических индексов удерживания и относительных оптических плотностей пестицидов в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

В работе использованы пестициды, перечень которых представлен в таблице 2.1., а также соединения (1-23) с общей структурной формулой RRP(=X)SR (таблица 2.2.), синтезированные в Институте элементорганических соединений (Москва) , физико-химические свойства которых охарактеризованы в . Разделение соединений методом обращенно-фазовой ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе «Waters» с колонкой Nova-Рас Qg (3,9 х 150 мм) и УФ-детектированием при длинах волн 220 и 254 нм. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с водой, расход элюента 1 мл/мин. Анализ проводили в градиентном режиме элюирования с начальной концентрацией CH3CN, равной 10%, и скоростью ее изменения 1,5 % в минуту. Мертвое время системы определяли дозированием раствора бромида калия (220 нм). Регистрацию времен удерживания осуществляли с помощью программного обеспечения «Millennium». Для определения значений ИУ в образцы вводили смесь реперных н-алкилфенилкетонов PhCOCnH2n+i (n = 1-3,5). Линейно-логарифмические индексы удерживания [ИУ(ВЭЖХ)] рассчитывали с использованием программы (QBasic), приведенной в руководстве . Для вычисления значений ИУ (ВЭЖХ) соединений, имеющих меньшие, чем у первого реперного компонента (ацетофенон) времена удерживания, применяли алгоритм экстраполяции времен удерживания, охарактеризованный в . Для определения относительных оптических плотностей Аотн.= А(254)/А(220) хроматограммы параллельно регистрировали на двух указанных длинах волн с последующим вычислением отношений площадей пиков Аот„= S(254)/S(220). Расчет параметров уравнения линейной регрессии вида: log Р = al +b, где / - индексы удерживания веществ в обращенно-фазовой ВЭЖХ, a, b -коэффициенты уравнения; осуществляли с помощью программного обеспечения Origin for Windows.

Оценки значений log Р по аддитивным схемам (исходя из инкрементов log Р молекулярных фрагментов ) проводили с использованием программного обеспечения ACD и CS ChemDraw Ultra. Особенности количественной оценки содержания пестицидов в растительных объектах [огурцы (замороженные), солома, колосья, зерно] характеризовали на примере трех соединений: диметоата, пиримикарба и малатиона. Стандартные растворы пестицидов в ацетоне (х.ч.) с концентрацией 0,1 мг/мл (и 0,01 мг/мл для диметоата) готовили путем разведения исходных основных растворов с концентрацией 1 мг/мл и максимально равномерно вносили (1-2,5 мл) в необработанные (контрольные) растительные образцы с последующим встряхиванием и перемешиванием в течение 5 мин. Отсутствие определяемых пестицидов в контрольных образцах подтверждали экспериментально при использовании Подготовку проб для дальнейшего хроматографического анализа осуществляли двумя способами: с проведением ЖЭ (огурцы, солома, колосья, зерно) и с использованием ТФЭ (огурцы) Пробоподготовка с использованием жидкостной экстракции. Подготовку проб, содержащих диметоат и малатион, проводили по методике группового определения фосфорорганических пестицидов . Она включала экстракцию пестицидов из огуречных проб 50% водным ацетоном (для повышения эффективности экстракции использовали ультразвуковую ванну).

Полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывали 50% водным ацетоном. Повторную экстракцию пестицидов из водно-ацетоновых растворов осуществляли дихлорметаном (три раза по 30 мл). Дихлорметановые растворы сушили, пропуская их через слой безводного сульфата натрия (ч.д.а.) и упаривали досуха в вытяжном шкафу при комнатной температуре в токе воздуха. Сухой остаток растворяли в 10 мл гексана и хроматографировали. Подготовку проб, содержащих пиримикарб, проводили с использованием методики, приведенной в . Она основана на извлечении пестицида из анализируемых объектов 0,1 н раствором соляной кислоты. Полученные экстракты подщелачивали 1 н раствором едкого натра до рН 8-10 и реэкстрагировали пиримикарб хлороформом (двумя порциями по 75 мл). Хлороформные экстракты сушили, пропуская их через слой безводного сульфата натрия, и упаривали досуха в вытяжном шкафу при комнатной температуре в токе воздуха. Сухой остаток растворяли в 10 мл гексана и хроматографировали. Пробоподготовка с использованием твердофазной экстракции. Пестициды из анализируемых проб экстрагировали 50% водным ацетоном (на ультразвуковой ванне). После фильтрации водно-ацетоновых растворов и промывки осадка на фильтре (50% водным ацетоном), ацетон из объединенных экстрактов полностью упаривали. Оставшиеся водные растворы снова фильтровали через бумажный фильтр. Перед тем, как использовать в работе отечественные сорбенты Диапак С16 (партия № 1002), их активировали (активация патронов см. выше п. 2.2.). После этого прокачивали через патроны, анализируемые водные растворы со скоростью не более 2 мл/мин, создавая разрежение на выходе водоструйным насосом. Затем патроны сушили 30 минут в токе гелия. В качестве элюирующих растворителей использовали: гексан (20 мл), дихлорметан (20 мл) и ацетон (15 мл). Элюаты упаривали досуха в вытяжном шкафу при комнатной температуре.

Остатки после упаривания растворяли 10 мл гексана и хроматографировали. Газохроматографический анализ при совместном присутствии диметоата, пиримикарба и малатиона выполняли с использованием прибора «Цвет 55ОМ», укомплектованного термоионным детектором и стеклянной колонкой 2 м х 3 мм, заполненной 5% SP 2100 на Хромосорбе W (0,200 -0,250 мм). Температура колонки 220, испарителя 250, детектора 390С. Расход газа-носителя (азота) - 30 мл/мин, водорода 14 мл/мин, воздуха 200 мл/мин. Газохроматографический анализ диметоата проводили на приборе «Цвет 550М» с термоионным детектором и стеклянной колонкой 1 м х 3 мм, заполненной 5% SE-30 на Хроматоне N Super (0,125 - 0,160 мм). Температура колонки 200, испарителя 240, детектора 320С. Расход газа-носителя (азота) - 28 мл/мин, водорода 14 мл/мин, воздуха 200 мл/мин. Для дозирования проб (1 мкл) использовали микрошприц «Hamilton». Количественную оценку содержания пестицидов в анализируемых образцах с использованием метода внешнего стандарта осуществляли по уравнению (во всех случаях анализируемые объемы были одинаковы и составляли 10 мл):

Оценка параметров гидрофобности потенциальных фосфорорганических пестицидов по их индексам удерживания в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

Среди различных свойств органических соединений коэффициенты распределения в системе 1-октанол/вода (log Р) занимают особое место. Этот параметр, предложенный как мера гидрофобности органических соединений , используют для различных целей. Одной из них является прогнозирование поведения экотоксикантов в объектах окружающей среды . Рассмотрение известных данных по деградации пестицидов в растениях и почве свидетельствуют об отчетливо выраженной зависимости продолжительности их обнаружения в таких объектах от параметров гидрофобности. Так, например, сравнительная характеристика пиретроидов и фосфорорганических пестицидов (значения log Р пиретроидов в среднем на 2-4 единицы больше, чем для ФОП) свидетельствуют о более длительном сохранении пиретроидов в различных сельскохозяйственных культурах (на 1-2 недели больше), несмотря на существенно меньшие (в несколько раз) нормы расходов. Даже в пределах одного класса соединений хорошо прослеживается зависимость продолжительности регистрации пестицидов в почве от их гидрофобности.

Например, более гидрофобные ФОП (log Р 3-4) обнаруживаются на 5-15 суток дольше, чем менее гидрофобные (log Р 1). Кроме оценки и предсказания поведения пестицидов в различных объектах окружающей среды, значения log Р могут быть использованы в качестве одного из критериев отбора новых перспективных средств защиты растений. Так, полагают , что инсектицидная активность фосфорорганических соединений также коррелирует с их гидрофобностью, и, таким образом, значения log Р, могут оказаться полезными при поиске новых инсектицидов. При проведении пробоподготовки с использованием ТФЭ на модифицированных силикагелях, как отмечено в обзоре литературы, эффективность экстракции пестицидов ряд авторов связывают с их гидрофобностью. Поэтому данный параметр представляет интерес не только для характеристики экологического поведения или для поиска новых перспективных пестицидов, но и с аналитических позиций. Экспериментальное определение log Р в системе 1-октанол/вода связано со значительными трудностями, главной из которых следует считать образование медленно расслаивающихся эмульсий обоих растворителей друг в друге. Это приводит к неоправданно длительному установлению равновесия, отсутствие которого проявляется в низкой межлабораторной воспроизводимости значений log Р для многих веществ (некоторые оценки на примере пестицидов см. в ). Известные методы определения log Р можно условно разделить на две группы - прямые и косвенные.

Прямые методы основаны на непосредственном измерении равновесных концентраций веществ в обеих (или в одной, чаще всего - водной) сосуществующих фазах. Классическим примером таких способов является широко распространенный метод «встряхивания колбы» , позволяющий определять значения log Р в диапазоне от -2,5 до +4,5. Однако в ряде случаев межлабораторная воспроизводимость получаемых с его помощью данных достигает ± 1,3 единиц log Р . Другие же методы определения log Р либо длительны , либо требуют использования специального оборудования . Сложности непосредственного измерения значений log Р привели к появлению большого количества косвенных методов их оценки. Одни из них основаны на расчете log Р по аддитивным схемам (исходя из инкрементов log Р молекулярных фрагментов , в том числе с помощью современного программного обеспечения (ACD или CS ChemDraw), другие предполагают использование двухпараметровых уравнений линейной регрессии вида (8), коэффициенты которых вычисляют методом наименьших квадратов по наборам данных для ранее охарактеризованных веществ:

В число параметров А включают как молекулярные характеристики -поляризуемость (молекулярная рефракция), потенциал ионизации, дипольный момент , так и некоторые физико-химические константы - температура кипения, растворимость в воде (только в пределах гомологических рядов) , а также экспериментально определяемые параметры удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ (обычно используют логарифмы факторов удерживания или коэффициентов емкости log к1) . Несмотря на большое число примеров характеристики гидрофобности сорбатов по значениям log к (ВЭЖХ), такие хроматографические инварианты как индексы удерживания, менее зависимые от условий разделения, чем коэффициенты емкости, для этих целей до настоящего

Сравнение методов внешнего стандарта и стандартной добавки для оценки содержания пестицидов в растительных объектах

Оценка уровня содержания пестицидов в растительных объектах является ответственным и заключительным этапом в определении следовых количеств экотоксикантов. В обзоре литературы отмечено, что для этой цели используют два метода количественного хроматографического анализа: наиболее популярный - метод внешнего стандарта (разновидность метода абсолютной градуировки) и метод внутреннего стандарта. Широкое использование метода внешнего стандарта вероятно связано с простой процедурой определения.

Она заключается в анализе растворов стандарта и пробы, полученной из целевого образца с дальнейшим определением концентрации пестицида по пропорции: где Сх, Сст. - концентрации аналита в исследуемом и стандартном растворах; Мх, Мет. - количество аналита в исследуемом и стандартном растворах (при равенстве их объемов); Рх, Рст# - площадь (высота) пика аналита в исследуемом и стандартном растворах, Оценку случайной составляющей погрешности результатов количественного определения методом внешнего стандарта проводят по соотношениям: где 5СХ, 5Сст., - погрешности определения и задания концентраций пестицида в анализируемом и стандартном растворах; 5МХ, 8МСТ. погрешности определения и задания количеств пестицида в анализируемом и стандартном растворах (при равенстве их объемов); 8РХ, SPSCT. - погрешности определений площадей (высот) пиков пестицида в исследуемом и стандартном растворах. Однако на разных стадиях полготовки проб к хроматографическому анализу могут наблюдаться значительные потери пестицидов, что приводит к снижению их концентрации в конечном исследуемом растворе, и как следствие этого, к заниженным результатам определений. В обзоре литературы отмечено также, что метод внутреннего стандарта позволяет уменьшить влияние систематической погрешности на конечные результаты анализов. Его преимущество при этом было бы неоспоримо, если бы не возникали затруднения при выборе внутренних стандартов. В тоже время, такая разновидность метода внутреннего стандарта как метод стандартной добавки до настоящего времени не нашла своего применения для оценки содержания пестицидов в растительных (и других) объектах. Этот способ предусматривает использование в качестве внутреннего стандарта самого определяемого соединения. Для установления его содержания в образце (Сх) необходим анализ двух проб: исходной пробы и пробы после введения в нее известного количества стандартной добавки.

По простой пропорции (при равенстве анализируемых объемов), связывающей прирост хроматографического сигнала с добавкой исследуемого соединения, определяют его первоначальное содержание в образце: определяемое количество аналита в исходном образце; МДОб. -добавка образца сравнения; Рх, Рх+ДОб. - площади (высоты) пиков аналитов в образцах, соответствующих исходной пробе и пробе с добавкой;.т - масса исходного образца, V - объем анализируемого образца. Случайную погрешность результатов количественных определений (5МХ) методом стандартной добавки (при 8МДОб « SP и SV« 8 МДОб.) можно оценить по соотношению: где 8РХ, 8Рх+ДОб - погрешности определений площадей (высот) пиков аналитов в исходной пробе и пробе с добавкой. Сопоставление выражений (15) и (16) показывает, что случайная составляющая погрешности определений методом стандартной добавки при Рх Рх+доб будет больше, чем методом внешнего стандарта так как (Рх+ДОб / (Рх+доб - Рх) » 1, но при Рх+доб » Рх и, следовательно, Рх+доб / (Рх+Доб - Рх) « 1 они сравнимы по величине. Кроме того, ее дополнительным источником является двукратное увеличение числа экспериментальных операций при пробоподготовке. Тем не менее, уменьшение влияния систематической погрешности при использовании метода стандартной добавки (также как и в методе внутреннего стандарта), как правило, позволяет существенно снизить суммарную погрешность определений. Затраты времени на выполнение хроматографических определений методами внешнего стандарта и стандартной добавки примерно одинаковые. Однако число операций пробоподготовки при использовании метода стандартной добавки удваивается

Кочмола, Николай Максимович

Изобретение относится к экологии, а именно способу одновременного определения пестицидов разных химических классов в биологическом материале. Для этого печень рыбы гомогенизируют с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия, экстрагируют ацетонитрилом, встряхивают и отстаивают. Далее пробы центрифугируют при 3000 об/мин и добавляют сорбенты - силикагель С-18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия, после чего повторяют центрифугирование. Полученный раствор упаривают, сухой остаток растворяют в ацетонитриле и анализируют с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором. Изобретение позволяет оценивать уровень загрязнения пестицидами биологических объектов при проведении экологического мониторинга. 2 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области экологической химии и может быть использовано для совместного определения пестицидов разных химических классов в одной пробе.

Проблема загрязнения окружающей среды пестицидами возникла в середине 50-х годов 20 века, когда производство и применение этих веществ приняли массовый характер. Пестициды как экотоксиканты с каждым годом оказывали все более заметное влияние на живую природу и здоровье человека.

Пестициды, используемые в сельском хозяйстве, в растворенном и твердом виде вносятся в акватории рек и морей, где происходит их седиментация в донных отложениях или разбавление в водной массе. Загрязнение водоемов пестицидами и продуктами их разложения весьма опасно для их нормального биологического функционирования. При рациональном применении химикатов в сельском хозяйстве в водоемы попадает минимальное количество препаратов.

Несмотря на сравнительно низкие концентрации в воде и донных отложениях пестициды могут довольно интенсивно накапливаться в жизненно важных органах и тканях гидробионтов, особенно у рыб, как высшего трофического звена в водных экосистемах. В организм рыб пестициды поступают в основном осмотически через жабры и частично кожу, через кормовые объекты, распределяются по всем органам и тканям, концентрируясь в наибольших количествах во внутренних органах (печени, почках, стенке кишечника, селезенке). Так как пестициды обладают свойством растворяться и накапливаться в жирах, то они почти не выводятся из организма. И даже незначительное, но постоянное поступление пестицидов приводит к повышению их концентрации в жировых запасах рыб.

Задача определения не заведомо известных веществ, а набора соединений из всего списка применяемых на практике пестицидов, количество которых превышает 1000 названий, является наиболее сложной.

Существующие в мире методики определения содержания пестицидов в рыбе (QuEChERS) пока не нашли широкого применения в научно-исследовательской и прикладной области. Пестициды определяют, главным образом, с помощью метода газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС), когда идентификация пестицидов осуществляется по заранее созданной библиотеке масс-спектров. Темпы развития ВЭЖХ для определения остатков пестицидов в настоящее время почти в 2 раза превышают темпы развития газожидкостной хроматографии..

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - один из самых информативных аналитических методов. Он широко используется во всех развитых странах, но, по сравнению с другими физико-химическими методами анализа, требует весьма высокой квалификации персонала, а стоимость одного анализа достигает нескольких десятков и даже сотен долларов США. Таким образом, упрощение самой процедуры ВЭЖХ-анализа и снижение ее стоимости представляется важной задачей.

Указанные недостатки ВЭЖХ обусловлены тем, что для каждого пестицида (или группы пестицидов) нормативные документы регламентируют свой «уникальный» вариант ВЭЖХ-анализа. Это приводит к необходимости часто перестраивать хроматограф, что занимает много времени и требует определенного опыта. Кроме того, аналитическая лаборатория, выполняющая анализы с привлечением многих разных методик, вынуждена содержать целый склад дорогостоящих колонок, органических растворителей и стандартных образцов пестицидов.

К пестицидам, определяемым в мировой практике методом ВЭЖХ, относятся труднолетучие и термолабильные соединения. Кроме того, ВЭЖХ позволяет проводить совместное определение пестицидов и их метаболитов. В анализе пестицидов методом ВЭЖХ особенно важны способы пробоподготовки.

Известен способ определения ХОП в мясе, мясопродуктах и в рыбе, состоящий в том, что мясо и мясопродукты пропускают через мясорубку. Рыбу очищают от чешуи, внутренних органов и тоже пропускают через мясорубку. 20 г пробы перемешивают с безводным сернокислым натрием и помещают в колбу с притертой пробкой. Пестициды экстрагируют дважды смесью гексан-ацетон или петролейный эфир-ацетон в соотношении 1:1 порциями по 50 мл в течение 1,5 часов при встряхивании. Экстракт фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводным сернокислым натрием, затем растворитель отгоняют, сухой остаток растворяют в 20 мл н-гексана и вносят его в колонку с силикагелем АСК. После впитывания экстракта в сорбент пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8 порциями по 25-30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу со шлифом емкостью 250-300 мл. Через 10 минут после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимают с помощью груши. Элюат отгоняют до объема 0,1 мл и наносят на хроматографическую пластинку. В том случае, если пробы мяса или рыбы содержат большое количество жира, после испарения первого экстрагента (смеси ацетона с гексаном) и растворения сухого остатка в гексане следует провести очистку гексанового экстракта серной кислотой, а затем колоночную очистку, как описано выше, (www.bestdravo.ru Методические указания по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях хроматографией в тонком слое. Утвержден зам. Главного гос. санитарного врача СССР А.И. Заиченко 28 января 1980 г. №2142-80. Текст документа по состоянию на июль 2011 года).

Недостатком данного способа является его низкая чувствительность, сложность и длительность проведения анализа.

Известен также «Способ определения тетраметилтиурамдисульфида в биологическом материале» (Патент РФ №2415425, МПК G01n 33/48, 2009), в котором проводят измельчение биологической ткани, двукратную обработку этилацетатом по 30 мин. массой в 2 раза больше ткани, фильтрацию безводным сульфатом натрия, испарение растворителя, растворение остатка в ацетонитриле, разбавленном водой в соотношении 1:4. Далее дважды экстрагируют пробу порциями хлороформа, экстракты объединяют, упаривают, остаток растворяют в подвижной фазе гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему), очищают в колонке с силикагелем L 40/100µ с применением подвижной фазы, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в подвижной фазе и проводят определение методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предложенному способу (прототип) является «Способ определения тиоклоприда в биологических объектах с использованием ВЭЖХ» (Патент РФ №2517075, МПК G01n 30/95, 2012). Способ состоит из отбора пробы, экстракции, фильтрации, дегидратации натрия сульфатом безводным, упаривания, введения растворенного сухого остатка в жидкостный хроматограф, обработки результатов анализа, а в качестве пробы берут навеску органов или тканей животных массой от 50 до 200 мг, экстракцию проводят ацетоном, растворенный сухой остаток вносят в жидкостный хроматограф «Хромос-ЖХ301» с детектором спектрофотометрическим UVV104M, используют колонку Диасфер-НОС-16(150×4)мм с размером пор сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 30:70.

Оба описанных способа позволяют определить лишь один пестицид в биологическом материале.

Технической задачей предлагаемого изобретения является обеспечение совместного определения нескольких пестицидов в одной пробе за счет повышения чувствительности способа.

Техническая задача решается тем, что способ определения пестицидов в биологическом матриале с использованием ВЭЖХ включает отбор пробы, экстракцию органическим растворителем, упаривание, растворение сухого остатка и введение его в хроматограф, обработку результатов анализа, в качестве пробы берут навеску печени рыбы, гомогенизируют ее с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия, экстрагируют ацетонитрилом, встряхивают и отстаивают, далее центрифугируют при 3000 об/мин и добавляют сорбенты - силикагель С18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия, после чего повторяют центрифугирование, сухой остаток растворяют в ацетонитриле, затем анализируют с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором.

Техническим результатом изобретения является обеспечение совместного определения нескольких пестицидов в одной пробе за счет повышения чувствительности способа.

О влиянии отличительных признаков на технический результат.

1. Использование в качестве пробы навески печени рыбы, как органа, в наибольшей степени накапливающего токсиканты, приводит к наиболее точному количественному результату определения. Печень играет большую роль в детоксикации вредных веществ, а высокое содержание жира ведет к накоплению в ней липофильных веществ, к которым относятся и пестициды нового поколения.

2. Гомогенизация пробы печени с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия дает эффективное осушение пробы от излишков влаги и поддержание постоянной pH.

3. Ацетонитрил является очень сильным и почти универсальным экстрагентом, обеспечивая хорошее извлечение всего набора анализируемых веществ. Жир печени, мешающий проведению хроматографического определения, очень трудно растворяется в ацетонитриле, что также приводит к увеличению числа определяемых пестицидов.

4. Проводимое дважды центрифугирование при 3000 об/мин. позволяет наилучшим образом отделить экстракт от частиц сорбентов, сульфата натрия и излишков жира при помощи простой декантации без применения фильтрования, что дает возможность повысить чувствительность способа..

5. Использование в качестве сорбентов силикагеля-С18, Bondesil-PSA и безводного сульфата натрия обеспечивает качественную очистку экстракта от липидов, жирных кислот, пигментов и других мешающих примесей.

6. Наконец, ВЭЖХ с УФ-детектором обладают высокой точностью определения.

Таким образом, совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение указанного результата, а именно совместного определения нескольких пестицидов разных классов в одной пробе за счет повышения чувствительности.

В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявляемого изобретения, а определение прототипа из имеющихся аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».

При дополнительном поиске других решений, относящихся к предлагаемому способу, указанных отличительных признаков не обнаружено.

Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Способ осуществляется следующим образом.

Пробу печени рыбы гомогенизируют с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия. Затем добавляют ацетонитрил и после интенсивного встряхивания отстаивают. После этого смесь центрифугируют при 3000 об/мин, ацетонитрильный слой сливают и добавляют сорбенты (силикагель С18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия), встряхивают и отстаивают. После отстаивания повторяют центрифугирование, ацетонитрильный слой сливают и концентрируют досуха при температуре не выше 50°C. Сухой остаток растворяют в ацетонитриле и анализируют на ВЭЖХ с УФ-детектором.

Примеры осуществления способа.

Пример 1. 5 г печени рыбы (кефаль-пиленгас) гомогенизировали в пробирке объемом 50 дм с 10 г безводного сульфата натрия и 0,6 г гидроцитрата натрия. Затем добавили 8 дм 3 ацетонитрила и после интенсивного встряхивания в течение 1 минуты отстаивали 30 минут.

После этого смесь центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин, ацетонитрильный слой сливали в пробирку объемом 15 дм 3 и добавляли 50 мг сорбента Bondesil-PSA, 50 г сорбента С18 и 1,2 г безводного сульфата натрия, интенсивно встряхивали 1 минуту и отстаивали 30 минут. Затем смесь центрифугировали повторно 5 минут при 3000 об/мин, ацетонитрильный слой сливали в колбу объемом 100 мл и концентрировали до объема 1 мл на вакуумном концентраторе при температуре 40°C.

Растворитель и сухой остаток растворяли в 1 см 3 ацетонитрила и анализировали на жидкостном хроматографе фирмы "Applied Biosystems" (США) с ультрафиолетовым детектором, снабженным дегазатором и термостатом колонки. Колонка 4,6×150 мм Reprosil-PUR ODS-3,5 мкм (Элсико, Россия); рабочая длина волны - 230 нм, термостатирование - +40°C; подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 60:40 (по объему) в изократическом режиме; скорость потока 0,6 мл/мин, объем вводимого в хроматограф экстракта пробы - 10 мкл. Идентификацию пестицидов проводили по времени удерживания.

Количественное содержание определяли исходя из площади хроматографического пика по уравнению калибровочного графика.

В результате обнаружены следующие пестициды (мг/кг): 1-имазалил 1,1014; 2-имазапир 0,8996; 3-имидаклоприд 0,596; 4-имазетапир 0,6776; 5-ципросульфамид 0,9136; 6-метрибузин 0,7294; 7-флумиоксазин 1,3232; 8-хизалофоп-П-этил 0,7704; 9-этофумезат 1,2012; 10-ипродион 1,1248; 11-димоксистробин 1,4122; 12-фамоксадон 3,925; 13-пенцикурон 3,0524.

На рис. 1 приведена хроматограмма смеси пестицидов, обнаруженных в пробе (пример 1), на рис. 2 - пример калибровочного графика одного из пестицидов (имазапир). Уравнение калибровки Y=0.377192X.,

Пример 2. Аналогично примеру 1, анализ проводили без предварительной гомогенизации пробы печени. В результате обнаружено примерно на 50% меньше пестицидов, чем в примере 1, что объясняется необходимостью гомогенизации для увеличения степени извлечения.

Пример 3. Аналогично примеру 1, исключили повторное центрифугирование.

В результате проба оказалась загрязнена и степень извлечения пестицидов уменьшилась. Так как после первого центрифугирования в пробу вводили сорбенты, образовалась взвесь, которую было необходимо удалить с помощью повторного центрифугирования.

Пример 4. Аналогично примеру 1, исключили использование сорбента силикагель С18. В результате незначительно уменьшилось количество определяемых веществ, но появились артефакты.

Таким образом, опыты показывают, что оптимальным является пример 1, описанная последовательность действий с пробой печени с использованием вышеупомянутых ацетонитрила в качестве эстрагента и набора сорбентов позволяет выявить наибольшее количество пестицидов.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом является более простым, экономичным и результативным, т.к. позволяет определить 10-13 пестицидов в одной пробе вместо одного.

Способ может быть использован в Роспотребнадзоре для мониторинга загрязнения пестицидами биологических объектов, организациях экологического профиля, в научно-исследовательских разработках.

Способ определения пестицидов в биологическом материале с использованием ВЭЖХ, включающий отбор пробы, экстракцию органическим растворителем, упаривание, растворение сухого остатка и введение его в хроматограф, обработку результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве пробы берут навеску печени рыбы, гомогенизируют с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия, затем экстрагируют ацетонитрилом, встряхивают и отстаивают, далее центрифугируют при 3000 об/мин и добавляют сорбенты - силикагель С-18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия, после чего повторяют центрифугирование, сухой остаток растворяют в ацетонитриле и анализируют с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором.

Похожие патенты:

Изобретение относится к аналитической химии и касается способа определения селена в воде. Сущность способа заключается в том, что к анализируемому раствору добавляют 0,4 мл раствора 3%-ного щелочного борогидрида натрия восстановителя, закрывают пробкой, встряхивают и оставляют на 5 мин для восстановления селена до селеноводорода.

Изобретение относится к области неразрушающего контроля материалов и изделий по условиям прочности и предназначено для контроля процесса трещинообразования хрупких тензоиндикаторов при изменении уровня напряженности в исследуемых зонах конструкции.

Изобретение относится к области биохимии и касается способа получения аналитической тест-системы (MRM-теста) для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, включающего выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей; отбор по меньшей мере двух маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка; предсказание фрагментов пептидов; предсказание MRM-теста в виде перечня маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции; синтез маркерных пептидов; определение профиля переходов синтетических маркерных пептидов; оптимизацию MRM-теста в соответствии с полученными профилями; очистку пептидов; подготовку биологического образца; идентификацию белка в биологическом образце с заколом синтетических пептидов; определение значений времени удержания маркерных пептидов с внесением установленных значений в MRM-тесты; проведение мультиплексных калибровочных измерений; количественное измерение содержания маркерных пептидов в биологическом образце; и суждение о содержании интересующих белков в биологическом образце.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу определения микропримесей мышьяка и сурьмы в лекарственном растительном сырье. Способ заключается в переводе соединений мышьяка и сурьмы в соответствующие гидриды путем восстановления смесью, содержащей 40%-ный раствор иодида калия, 10%-ный раствор аскорбиновой кислоты, 4 M раствор соляной кислоты и цинк металлический.

Группа изобретений относится к области экологии и воздухотехнического оборудования и предназначена для измерения качества воздуха. Для измерения качества воздуха осуществляют отбор проб воздуха с первой частотой выборки, чтобы получить множество проб качества воздуха при использовании первого датчика.

Изобретение относится к судебной медицине, а именно к определению использования гладкоствольного оружия для нанесения огнестрельных повреждений. Предложенный способ включает выделение частиц на преграде, изучение их визуально, помещение выделенных частиц на предметное стекло в 2-3 капли дистиллированной воды, при нагревании до температуры плавления парафина на поверхности воды образуется прозрачная тонкая пленка, а при охлаждении формирующиеся кусочки приобретают первоначальные физико-механические свойства парафина, что свидетельствует об использовании гладкоствольного оружия для нанесения огнестрельных повреждений.

Изобретение относится к области фундаментальной физики и может быть использовано при исследовании теплофизических свойств сверхтекучих квантовых жидкостей. Платина-платинородиевые термопары 1 и 2 погружают в расплав чистого борного ангидрида 5.

Изобретение относится к области океанологии, в частности сейсмологии и гидробиологии, и может быть использовано для экспресс-оценки повышенной геофизической активности в морских акваториях, приводящей к землетрясениям.

Изобретение относится к области экологии, а именно к оценке качества атмосферного воздуха населенных мест по состоянию эпифитной лихенофлоры. Для этого вычисляют индекс загрязнения воздуха (ИЗА) по жизненности лишайников в пределах 89%, сравнивая его с комплексным показателем, определяемым на учетной площадке, и коэффициента толерантности лихенофлоры по отношению к индексу загрязнения воздуха, который исчисляется по формуле ИЗА=(0,89-G/89)/0,298, где 0,89 - максимальная относительная жизненность лихенофлоры в чистом воздухе; G% - комплексный показатель жизненности лихенофлоры на площадке лихеноиндикации; 89% - теоретически возможное максимальное значение жизненности лихенофлоры в чистом воздухе, выраженное в процентах; 0,298 - коэффициент толерантности лихенофлоры к ИЗА. Значение ИЗА около 1 и наличие всех видов лишайников показывает благоприятную экологическую обстановку и качество атмосферного воздуха; при оценке в пределах 5-6 единиц оценивают повышенное загрязнение; оценка 7-13 характеризует высокое загрязнение; оценка выше 14 характеризует очень высокое загрязнение. Изобретение позволяет произвести экологическую оценку и вывести среднегодовой показатель загрязнения воздуха. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к экотоксикологии, а именно к исследованию особенностей развития оксидативного стресса у двухстворчатых моллюсков, и может быть использовано для выявления влияния техногенного загрязнения среды на состояние популяций речных и морских моллюсков. Для этого пробы гепатопанкреаса двухстворчатых моллюсков из загрязненных водоемов гомогенизируют в 10-кратном объеме 50 мМ трис-буфера рН 7,8, содержащего 2 мМ этилендиаминтетроацетат. Затем проводят анализ на содержание малонового диальдегида (МДА) и 4-гидроксиалкенов для определения уровня перекисного окисления липидов. Состояние моллюсков оценивают по результатам определения уровня окислительных повреждений липидов гепатопанкреаса по сравнению с контрольными образцами, взятыми из условно чистых водоемов. Изобретение обеспечивает возможность выявить на разных стадиях интоксикации нарушения метаболического баланса клеток, индуцированного действием загрязнителей водной среды. 3 ил., 3 пр.

Изобретение относится к измерению качества различных видовых комплексов трав и травянистых растений на пробах, преимущественно на пойменных лугах, и может быть использовано в экологическом мониторинге территорий с травяным покровом. Изобретение относится также к ландшафтам малых рек с луговой растительностью и может быть использовано при оценке видового разнообразия травы по наличию отдельных видов растений. Способ включает выделение на малой реке или ее притоке визуально по карте или натурно участка пойменного луга с травяным покровом, разметку на этом участке по течению малой реки или ее притока в характерных местах не менее трех гидрометрических створов в поперечном направлении. Вдоль каждого гидрометрического створа размечают пробные площадки с каждой стороны малой реки или ее притока. Выявляют закономерности показателей проб травы. Для подсчета разнообразия видов травяных растений на участке пойменного луга выделяют точки будущих центров комплексных пробных площадок. В каждом центре комплексных пробных площадок забивают колышки и концентрически устанавливают квадратные рамки с разными размерами сторон. Квадратные рамки устанавливают с ориентацией сторон вдоль и поперек русла малой реки или ее притока. Затем внутри каждой квадратной рамки сосчитывают количество видов травы и записывают в таблицы для каждого размера пробных площадок. После этого по каждой таблице вычисляют суммы видов травы и пробных площадок. По этим суммам вычисляют отношения к общей сумме видов травы и к общей сумме всех комплексных пробных площадок. Затем статистическим моделированием выявляют ранговые распределения по двум показателям: относительной встречаемости каждого вида травы на всех пробных площадках и разнообразия видов травы на каждой пробной площадке данного участка, после этого вычисляют коэффициент коррелятивной вариации по численности видов травы, а оценку видового состава травянистых растений осуществляют по ранговому распределению относительной встречаемости видов растений. Способ обеспечивает повышение точности учета наличия видов травяных и травянистых растений на всех пробных площадках при одновременном снижении трудоемкости анализа видового состава на них, упрощение процесса анализа видового состава только по численности видов на пробных площадках, повышение возможностей сравнения проб травы по двум показателям: относительной встречаемости каждого вида на всех пробных площадках и разнообразию (относительной встречаемости) видов травы на каждой пробной площадке данного участка, причем без срезания с пробных площадок травяных проб. 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл., 1 пр.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения диоктилфталата в равновесной газовой фазе над изделиями из ПФХ-пластизоля. Для этого применяют способ идентификации и полуколичественного определения диоктилфталата в смеси соединений, выделяющихся из ПВХ-пластизоля. Для определения диоктилфталата используют частотомер с массивом из 2-х пьезокварцевых резонаторов с собственной частотой колебаний 10 МГц, электроды которых модифицируют нанесением на них из индивидуальных растворов многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) массой пленки 3-5 мкг и полифенилового эфира (ПФЭ) массой 15-20 мкг. Модифицированные пьезокварцевые резонаторы помещают в закрытую ячейку детектирования и выдерживают в течение 5 мин для установления стабильного нулевого сигнала. Затем в пробоотборник помещают образец мягкого изделия из ПВХ-пластизоля массой 1,00 г, плотно закрывают пробкой и выдерживают при температуре 20±1°С в течение 15 мин для насыщения газовой фазы парами диоктилфталата. 5 см3 равновесной газовой фазы отбирают шприцем и инжектируют ее в закрытую ячейку детектирования и фиксируют в течение 120 с изменение частоты колебаний пьезосенсоров. Каждую секунду автоматически фиксируются отклики сенсоров, после чего регенерируют систему в течение 2 мин осушенным воздухом. Затем пробу в пробоотборнике нагревают в сушильном шкафу до 30±1°С в течение 10 мин, отбирают шприцем 5 см3 равновесной газовой фазы и повторно инжектируют в закрытую ячейку детектирования, фиксируют в течение 120 с изменение частоты колебаний пьезосенсоров при 20 и 30°С. По сигналам сенсоров автоматически рассчитывают площади под кривой для каждого сенсора: S(МУНТ), S(ПФЭ), Гц·с, и рассчитывают соотношение площадей при 20°С и 30°С соответственно - параметр. По указанным параметрам делают выводы о наличии диоктилфталата в образцах: если А30/20>20, то диоктилфталат присутствует в образцах изделий из ПВХ-пластизоля с концентрацией больше допустимого количества миграции (ДКМ, мг/дм3), если А30/20≤1, то содержание диоктилфталата на уровне допустимого количества миграции и его содержание меньше содержания других легколетучих соединений, присутствующих в пробе. Изобретение обеспечивает идентификацию и полуколичественное определение диоктилфталата, выделяющегося из ПВХ-пластизоля. 1 пр.

Изобретение относится к области обработки воздуха. Способ калибровки датчика воздуха устройства обработки воздуха включает в себя этапы, на которых: i) - очищают воздух, используя устройство обработки воздуха; ii) - измеряют первое количество воздуха, используя датчик воздуха для получения первого значения для калибровки датчика воздуха, причем первое количество воздуха представляет собой смесь окружающего воздуха и очищенного воздуха, причем устройство обработки воздуха расположено в воздухонепроницаемом пространстве, а этап 2 дополнительно включает в себя этапы, на которых: определяют, удовлетворяет ли качество первого количества воздуха в воздухонепроницаемом пространстве заданному критерию; и если качество первого количества воздуха удовлетворяет заданному критерию, измеряют первое количество воздуха, используя датчик воздуха, для получения первого значения. Это позволяет повысить точность измерений и, как следствие, оптимизировать работу устройства обработки воздуха. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к области аналитической химии для определения аминов в безводных средах. Для этого анализируемую пробу, содержащую амины, растворяют в ацетонитриле с добавкой от 0,01 до 1 моль/л инертной соли, погружают электрод с предварительно нанесенным на него покрытием толщиной от 10 нм до 10 мкм, состоящим из полимерных комплексов переходных металлов с основаниями Шиффа, и регистрируют вольтамперограмму в диапазоне потенциалов, включающем потенциалы от -0,2 до 1,2 В, со скоростью развертки в пределах 5-1000 мВ/с, которую сравнивают с эталонными вольтамперограммами известных аминов и по ним идентифицируют аналогичные эталонному образцу амины в анализируемой пробе хроноамперометрическим методом с использованием калибровочных кривых. В качестве инертной соли применяют тетрафторборат тетраэтиламмония или тетрафторборат аммония. Изобретение может применяться в химической, фармакологической, медицинской и пищевой промышленности для качественного и количественного анализа аминов. 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 пр.

Изобретение относится к методам определения состава и количества компонентов, входящих как в природные минералы, так и соединения, полученные в различных химических реакциях, при действии температуры и давления. Способ определения концентрации манганита лантана в смеси синтезированного порошка системы La(1-x)SrxMnO3, полученного смешиванием исходных составляющих в виде порошков La2O3, MnCO3 и SrCO3 и их последующим синтезом, включает определение коэффициента отражения порошка манганита лантана в видимой области спектра на длине волны 546 нм. Значение концентрации манганита лантана, соответствующее определенной величине коэффициента отражения в видимой области спектра на длине волны 546 нм, определяют по градуировочной зависимости, предварительно построенной для различных синтезированных порошков манганита лантана системы La(1-x)SrxMnO3 по данным рентгенофазового анализа, определяющим концентрацию манганита лантана, и значениям коэффициента отражения в видимой области спектра на длине волны 546 нм. Техническим результатом является определение концентрации манганита лантана для порошков, полученных в различных условиях. 4 ил., 1 табл., 7 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогноза течения умереннодифференцированных эндометриоидных карцином тела матки T1N0M0. Способ включает следующее. При размерах первичной опухоли в пределах 1 см определяют клетки опухоли матки, экспрессирующие Ki-67, топоизомеразу 2 альфа, рассчитывают коэффициент соотношения топоизомераза 2 альфа/Ki-67 и при значении коэффициента менее или равно 0,8 прогнозируют благоприятный исход без проведения адъювантной терапии. При значении коэффициента более 0,8 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания и рекомендуют проведение адъювантной терапии. Использование изобретения позволяет повысить точность и информативность прогноза течения умереннодифференцированных эндометриоидных карцином матки. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к фармацевтике, а именно к количественному определению производных имидазола, незамещенного в 5-положении, а именно гистидина гидрохлорида, гистамина дигидрохлорида, клотримазола, тиамазола, озагреля, бифоназола в субстанциях лекарственных препаратов. Для приготовления испытуемых растворов точный объем ампульного раствора 4% гистидина гидрохлорида (1 мл) помещают в колбу на 25 мл в 10 мл воды очищенной, перемешивают и доводят тем же растворителем до метки; точно отмеренный объем 0,1% гистамина дигидрохлорида (1 мл) или точные навески клотримазола (около 0,1 г), тиамазола (около 0,005 г), озагреля (около 0,01 г), бифоназола (около 0,005 г) помещают в мерные колбы емкостью 50 мл, растворяют в метаноле при комнатной температуре до полного растворения, а затем доводят объемы колб этим же растворителем до метки. Затем в мерные колбы емкостью 20 мл точно отбирают по 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 мл приготовленного раствора гистидина гидрохлорида и клотримазола, по 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 мл раствора гистамина дигидрохлорида, по 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 мл раствора тиамазола, по 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 мл раствора озагреля и по 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 мл раствора бифоназола. В каждую колбу прибавляют по 5,5 мл раствора диазотированного п-анизидина в соляной кислоте и доводят до метки метанолом, появляется окрашивание. Полученные через 2-3 минуты ярко-красные окрашенные растворы устойчивы в течение 2 часов. Пробы фотоэлектроколориметрируют при длине волны 490 нм и в кювете толщиной 10 мм. Количество определяемых препаратов рассчитывают с помощью калибровочных графиков. В качестве раствора сравнения используют раствор диазотированного п-анизидина в соляной кислоте. Изобретение обеспечивает простой, быстрый и воспроизводимый способ количественного определения лекарственных средств производных имидазола. 7 ил., 1 пр.

Изобретение относится к животноводству, а именно к способу оценки состояния здоровья молодняка крупного рогатого скота. Способ предусматривает использование в качестве диагностической биосреды шерсти животного, исследование образцов шерсти по 25 химическим элементам и оценку результатов исследования элементного статуса шерсти по центильной шкале. При значениях в интервалах от 10 до 24,9 центиля и от 75,01 до 90 центиля в центильной шкале состояние животного оценивают как нормальное. Использование изобретения позволит выявить ранние и скрытые формы нарушения здоровья животных. 3 табл.

Изобретение относится к экологии, а именно способу одновременного определения пестицидов разных химических классов в биологическом материале. Для этого печень рыбы гомогенизируют с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия, экстрагируют ацетонитрилом, встряхивают и отстаивают. Далее пробы центрифугируют при 3000 обмин и добавляют сорбенты - силикагель С-18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия, после чего повторяют центрифугирование. Полученный раствор упаривают, сухой остаток растворяют в ацетонитриле и анализируют с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором. Изобретение позволяет оценивать уровень загрязнения пестицидами биологических объектов при проведении экологического мониторинга. 2 ил., 4 пр.