Αντίστροφη μεταγραφάση (ρεβερτάση). «Ελβετικό μαχαίρι» του ιογενούς στρατού: αποκαλύφθηκε το μυστικό της αντίστροφης μεταγραφάσης Ένα απόσπασμα που χαρακτηρίζει την αντίστροφη μεταγραφάση

Η ρεβερτάση είναι ένα ένζυμο που συνθέτει cDNA σε ένα πρότυπο RNA.

Για ορισμένους ιούς, το γονιδίωμα δεν είναι DNA, ως συνήθως, αλλά RNA. Τέτοιοι ιοί ονομάζονταν ρετροϊοί (ρετρό - αντίστροφη). Το 1970, οι D. Baltimore και Kh.M. Temin ανακάλυψαν τον μηχανισμό μεταφοράς πληροφοριών από το ιικό RNA στο DNA, δηλ. το αντίθετο από αυτό που συμβαίνει στα κύτταρα των ανώτερων οργανισμών. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφή και το ένζυμο που την εκτελεί ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση ή αναβερτάση.

Αντίστροφη μεταγραφάση, ή ανάστροφη μεταγραφάση, [lat. μεταγραφή- επανεγγραφή) - το ένζυμο πολυμεράση DNA που εξαρτάται από το RNA, με τη βοήθεια του οποίου πραγματοποιείται η αντίστροφη μεταγραφή - η σύνθεση του DNA σε μια μήτρα RNA. κωδικοποιούνται από τα γονιδιώματα ορισμένων ιών RNA και τα κινητά γενετικά στοιχεία του γονιδιώματος των ανώτερων οργανισμών, ένα σημαντικό «εργαλείο» για τη γενετική μηχανική. Η ανάστροφη μεταγραφάση έχει τουλάχιστον τρεις ενζυματικές δραστηριότητες:

1) DNA πολυμεράση, η οποία χρησιμοποιεί και RNA και DNA ως πρότυπο.

2) τη δραστηριότητα της RNase H, η οποία υδρολύει το RNA ως μέρος ενός υβριδίου RNA-DNA, αλλά όχι μονόκλωνο ή δίκλωνο RNA και

3) Δραστικότητα ενδονουκλεάσης DNA.

Ανακαλύφθηκε ανεξάρτητα από τους D. Baltimore και H. Temin το 1970 σε ιούς όγκου που περιέχουν RNA (βραβείο Νόμπελ για το 1975 μαζί με τον R. Dulbecco).

Έτσι, οι αντίστροφες μεταγραφάσες είναι ικανές να συνθέσουν DNA σε ένα εκμαγείο RNA πολυμερίζοντας τέσσερις τριφωσφορικούς δεοξυριβονουκλεοζίτες. Και ακριβώς όπως οι πολυμεράσες DNA, λειτουργούν μόνο με την παρουσία ενός εκκινητή.

Οι αντίστροφες μεταγραφάσες χρησιμοποιούνται στη σύνθεση δίκλωνου DNA, συμπληρωματικού του RNA (ειδικά mRNA), για την επακόλουθη κλωνοποίησή του σε πλασμιδικούς φορείς κατά τη λήψη βιβλιοθηκών cDNA (clonoteks). Οι αντίστροφες μεταγραφάσες, όπως οι πολυμεράσες DNA, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή ραδιενεργών ή φθορίζουσα ετικέτασε ανιχνευτές DNA που περιέχουν κατάλληλα επισημασμένους τριφωσφορικούς δεοξυριβονουκλεοζίτες.

Η ικανότητα σύνθεσης DNA σε ένα εκμαγείο RNA υπό ορισμένες συνθήκες έχει αποδειχθεί για τη θερμοσταθερή DNA πολυμεράση του Thermus thermophilus. Αυτό επιτρέπει τη χρήση του για την άμεση ανίχνευση ειδικών RNA σε βιολογικά δείγματα με PCR. Οι σύγχρονες τροποποιήσεις αυτής της προσέγγισης καθιστούν δυνατή, σε ένα μείγμα αντίδρασης (και δοκιμαστικό σωλήνα), τη σύνθεση σε μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής ενός μικρού αριθμού αντιγράφων του ενισχυμένου θραύσματος DNA σε ένα πρότυπο RNA, τα οποία χρησιμοποιούνται αμέσως από το ίδιο ένζυμο με ένα πρότυπο σε συμβατική PCR (one tube PCR).

Ονομάζεται έτσι επειδή οι περισσότερες διαδικασίες μεταγραφής σε ζωντανούς οργανισμούς συμβαίνουν προς την άλλη κατεύθυνση, δηλαδή, ένα μεταγράφημα RNA συντίθεται από ένα μόριο DNA.

Ιστορία

Η αντίστροφη μεταγραφάση ανακαλύφθηκε από τον Howard Temin στο Πανεπιστήμιο του Wisconsin-Madison και ανεξάρτητα από τον David Baltimore το 1970. Και οι δύο ερευνητές έλαβαν το Νόμπελ Φυσιολογίας ή Ιατρικής το 1975, από κοινού με τον Renato Dulbecco.

Ακρίβεια μεταγραφής

Η αντίστροφη μεταγραφή από RNA σε DNA συνοδεύεται από υψηλό επίπεδολάθη μετάφρασης, αυτό διακρίνει την αντίστροφη μεταγραφάση από άλλες πολυμεράσες DNA. Αυτά τα σφάλματα μπορεί να οδηγήσουν σε μεταλλάξεις που ευθύνονται για την ανθεκτικότητα των ιών στα φάρμακα.

Σημασία για ιούς

Απαιτείται αντίστροφη μεταγραφή ιδιαίτερα για τον κύκλο ζωής των ρετροϊών, όπως ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας και το λέμφωμα των ανθρώπινων Τ-κυττάρων τύπου 1 και 2. Αφού το ιικό RNA εισέλθει στο κύτταρο, η αντίστροφη μεταγραφάση που περιέχεται στα ιικά σωματίδια συνθέτει DNA συμπληρωματικό προς αυτό και στη συνέχεια σε αυτόν τον κλώνο DNA, όπως σε μια μήτρα, συμπληρώνει τον δεύτερο κλώνο.

Σημασία για τους ευκαρυώτες

Εφαρμογή

Αντιρετροϊκή θεραπεία

Ρόλος στη γενετική μηχανική

Στη γενετική μηχανική, η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται για την παραγωγή cDNA, ένα αντίγραφο ενός ευκαρυωτικού γονιδίου που δεν περιέχει εσώνια. Για να γίνει αυτό, το ώριμο mRNA (που κωδικοποιεί το αντίστοιχο γονιδιακό προϊόν: πρωτεΐνη, RNA) απομονώνεται από το σώμα και πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή με αυτό ως πρότυπο. Το cDNA που προκύπτει μπορεί να μετασχηματιστεί σε βακτηριακά κύτταρα για να παραχθεί ένα διαγονιδιακό προϊόν.

δείτε επίσης

Γράψτε μια αξιολόγηση για το άρθρο "Αντίστροφη μεταγραφάση"

Σημειώσεις

Απόσπασμα που χαρακτηρίζει την Αντίστροφη Μεταγραφάση

- ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ! Ω! Ω!
- Λοιπόν, αντίο, Μπολκόνσκι! Αντίο, πρίγκιπα. «Έλα για φαγητό νωρίτερα», ακούστηκαν φωνές. - Σε φροντίζουμε.
«Προσπαθήστε να επαινείτε την τάξη στην παράδοση των προμηθειών και των διαδρομών όσο το δυνατόν περισσότερο όταν μιλάτε με τον αυτοκράτορα», είπε ο Μπίλιμπιν, συνοδεύοντας τον Μπολκόνσκι στην μπροστινή αίθουσα.
«Και θα ήθελα να επαινέσω, αλλά δεν μπορώ, όσο ξέρω», απάντησε ο Μπολκόνσκι χαμογελώντας.
- Λοιπόν, γενικά, μίλα όσο περισσότερο μπορείς. Το πάθος του είναι το κοινό. αλλά ο ίδιος δεν του αρέσει να μιλάει και δεν ξέρει πώς, όπως θα δείτε.

Στην έξοδο, ο αυτοκράτορας Φραντς κοίταξε μόνο προσεκτικά το πρόσωπο του πρίγκιπα Αντρέι, ο οποίος στεκόταν στο καθορισμένο μέρος μεταξύ των Αυστριακών αξιωματικών, και του κούνησε το μακρύ κεφάλι του. Αλλά αφού έφυγε από τη χθεσινή πτέρυγα, ο βοηθός μετέφερε ευγενικά στον Bolkonsky την επιθυμία του αυτοκράτορα να του δώσει ένα ακροατήριο.
Ο αυτοκράτορας Φραντς τον δέχτηκε, στεκόμενος στη μέση του δωματίου. Πριν ξεκινήσει τη συζήτηση, ο πρίγκιπας Αντρέι εντυπωσιάστηκε από το γεγονός ότι ο αυτοκράτορας φαινόταν μπερδεμένος, χωρίς να ξέρει τι να πει, και κοκκίνισε.
– Πες μου, πότε άρχισε η μάχη; – ρώτησε βιαστικά.
απάντησε ο πρίγκιπας Αντρέι. Αυτή η ερώτηση ακολουθήθηκε από άλλες, εξίσου απλές ερωτήσεις: «Είναι υγιής ο Κουτούζοφ; Πριν πόσο καιρό άφησε τον Κρεμς;» κ.λπ. Ο Αυτοκράτορας μίλησε με τέτοια έκφραση σαν να ήταν όλος ο στόχος του να κάνει μόνο έναν ορισμένο αριθμό ερωτήσεων. Οι απαντήσεις σε αυτά τα ερωτήματα, όπως ήταν πολύ προφανές, δεν μπορούσαν να τον ενδιαφέρουν.
– Ποια ώρα άρχισε η μάχη; - ρώτησε ο αυτοκράτορας.
«Δεν μπορώ να πω στην Μεγαλειότητά σας πότε ξεκίνησε η μάχη από το μέτωπο, αλλά στο Dürenstein, όπου βρισκόμουν, ο στρατός άρχισε την επίθεση στις 6 το βράδυ», είπε ο Bolkonsky, ξυπνώντας και ταυτόχρονα. με την προϋπόθεση ότι θα μπορούσε να παρουσιάσει αυτό που ήταν ήδη έτοιμο στο κεφάλι του μια αληθινή περιγραφή όλων όσων ήξερε και είδε.
Αλλά ο αυτοκράτορας χαμογέλασε και τον διέκοψε:
- Πόσα μίλια;
- Από πού και ως πού, Μεγαλειότατε;
– Από το Durenstein στον Krems;
- Τρεισήμισι μίλια, Μεγαλειότατε.
-Έχουν φύγει οι Γάλλοι από την αριστερή όχθη;
«Όπως ανέφεραν οι πρόσκοποι, οι τελευταίοι διέσχισαν σχεδίες εκείνο το βράδυ.
– Υπάρχει αρκετή χορτονομή στο Krems;
– Οι ζωοτροφές δεν παραδόθηκαν σε αυτή την ποσότητα...
Ο Αυτοκράτορας τον διέκοψε.
– Πότε σκοτώθηκε ο στρατηγός Schmit;...
- Στις επτά, νομίζω.
- Στις 7:00. Πολύ λυπηρό! Πολύ λυπηρό!
Ο Αυτοκράτορας είπε τις ευχαριστίες του και υποκλίθηκε. Ο πρίγκιπας Αντρέι βγήκε έξω και περικυκλώθηκε αμέσως από όλες τις πλευρές από αυλικούς. Ευγενικά μάτια τον κοίταξαν από όλες τις πλευρές και ακούστηκαν ευγενικά λόγια. Ο χθεσινός βοηθός τον επέπληξε που δεν έμεινε στο παλάτι και του πρόσφερε το σπίτι του. Ο Υπουργός Πολέμου πλησίασε, συγχαίροντας τον για το Τάγμα της Μαρίας Θηρεσίας, 3ης τάξης, που του είχε απονείμει ο Αυτοκράτορας. Η καμαριέρα της αυτοκράτειρας τον κάλεσε να δει την Αυτή Μεγαλειότητα. Ήθελε να τον δει και η Αρχιδούκισσα. Δεν ήξερε σε ποιον να απαντήσει και πήρε μερικά δευτερόλεπτα για να συγκεντρώσει τις σκέψεις του. Ο Ρώσος απεσταλμένος τον πήρε από τον ώμο, τον πήγε στο παράθυρο και άρχισε να του μιλάει.
Σε αντίθεση με τα λόγια του Bilibin, τα νέα που έφερε έγιναν δεκτά με χαρά. Είχε προγραμματιστεί μια ακολουθία των ευχαριστιών. Στον Κουτούζοφ απονεμήθηκε ο Μεγαλόσταυρος από τη Μαρία Θηρεσία και ολόκληρος ο στρατός έλαβε παράσημα. Ο Μπολκόνσκι έλαβε προσκλήσεις από όλες τις πλευρές και έπρεπε να κάνει επισκέψεις στους κύριους αξιωματούχους της Αυστρίας όλο το πρωί. Έχοντας ολοκληρώσει τις επισκέψεις του στις πέντε το απόγευμα, συνθέτοντας νοερά μια επιστολή στον πατέρα του για τη μάχη και για το ταξίδι του στο Μπρουν, ο πρίγκιπας Αντρέι επέστρεψε στο σπίτι στο Μπίλιμπιν. Στη βεράντα του σπιτιού που καταλάμβανε ο Μπίλιμπιν, στεκόταν μια μπρίτζκα μισογεμισμένη με πράγματα και ο Φραντς, ο υπηρέτης του Μπίλιμπιν, με δυσκολία σέρνοντας τη βαλίτσα του, βγήκε από την πόρτα.

Αντίστροφη μεταγραφάση (αντίστροφη ή εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση DNA) είναι ένα ένζυμο που καταλύει τη σύνθεση του DNA σε ένα πρότυπο RNA σε μια διαδικασία που ονομάζεται " αντίστροφη μεταγραφή». Το όνομα της διαδικασίας αντικατοπτρίζει το αντίθετο της διαδικασίας μεταγραφές, πραγματοποιείται προς την άλλη κατεύθυνση: ένα μεταγράφημα RNA συντίθεται από ένα μόριο μήτρας DNA.

Αυτά τα ένζυμα απομονώθηκαν από ιούς RNA ( ρετροϊούς). Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται από ιούς όγκου για τη μεταγραφή του mRNA στον συμπληρωματικό κλώνο του DNA. Κατά τη μελέτη ρετροϊών, το γονιδίωμα των οποίων αντιπροσωπεύεται από μονόκλωνα μόρια RNA, ανακαλύφθηκε ότι κατά την ενδοκυτταρική ανάπτυξη, ο ρετροϊός περνάει από το στάδιο ενσωμάτωσης του γονιδιώματός του με τη μορφή δίκλωνου DNA στα χρωμοσώματα του ξενιστή κύτταρο. Το 1964, ο Temin υπέθεσε την ύπαρξη ενός ειδικού για τον ιό ενζύμου ικανού να συνθέτει συμπληρωματικό DNA σε ένα πρότυπο RNA. Οι προσπάθειες που στόχευαν στην απομόνωση ενός τέτοιου ενζύμου στέφθηκαν με επιτυχία και το 1970 οι Temin και Mizutani, καθώς και, ανεξάρτητα, η Βαλτιμόρη ανακάλυψαν το επιθυμητό ένζυμο σε ένα παρασκεύασμα εξωκυτταρικών ιοσωμάτων του ιού σαρκώματος Rous. Αυτή η εξαρτώμενη από το RNA πολυμεράση DNA ονομάζεται ανάστροφη μεταγραφάση ή ρεβερτάση.

Η ρεβερτάση από ρετροϊούς πτηνών έχει μελετηθεί με περισσότερες λεπτομέρειες. Κάθε ιοσωμάτιο περιέχει περίπου 50 μόρια αυτού του ενζύμου. Η ανάστροφη μεταγραφάση αποτελείται από δύο υπομονάδες - a (65 kDa) και b (95 kDa), που υπάρχουν σε ισομοριακές ποσότητες. Η ανάστροφη μεταγραφάση έχει τουλάχιστον τρεις ενζυματικές δραστηριότητες:

1) DNA πολυμεράση, η οποία χρησιμοποιεί και RNA και DNA ως πρότυπο.

2) τη δράση της RNase Η, η οποία υδρολύει το RNA ως μέρος ενός υβριδίου RNA-DNA.

3) Δραστικότητα ενδονουκλεάσης DNA.

Οι δύο πρώτες δραστηριότητες απαιτούνται για τη σύνθεση ιικού DNA και η ενδονουκλεάση φαίνεται να είναι σημαντική για την ενσωμάτωση του ιικού DNA στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή. Η καθαρισμένη αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει DNA τόσο σε εκμαγεία RNA όσο και σε DNA (Εικ. 11).

Ρύζι. 11. Σχέδιο για τη σύνθεση αντιγράφων δίκλωνου DNA μορίων RNA

Για να ξεκινήσει η σύνθεση, η ρεβερσετάση, όπως και άλλες πολυμεράσες, απαιτεί μια κοντή δίκλωνη περιοχή (εκκινητήρας). Ο εκκινητής μπορεί να είναι ένα μονόκλωνο τμήμα τόσο του RNA όσο και του DNA, το οποίο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης συνδέεται ομοιοπολικά με τη νέα αλυσίδα DNA που συντίθεται. Στη γενετική μηχανική, χρησιμοποιούνται τόσο ολιγο-(dT) εκκινητές, συμπληρωματικοί στα άκρα 3"-polyA του mRNA, και ένα σύνολο εξανουκλεοτιδίων "τυχαία" σε σύνθεση και αλληλουχία (τυχαίοι εκκινητές). Συχνά για μόρια RNA με γνωστό πρωτογενές αλληλουχία που δεν έχει άκρα 3"- πολυ(Α) χρησιμοποιεί χημικά συντιθέμενα ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς το άκρο 3"

Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται κυρίως για τη μεταγραφή του αγγελιοφόρου RNA σε συμπληρωματικό DNA (cDNA). Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής διεξάγεται κάτω από ειδικά επιλεγμένες συνθήκες χρησιμοποιώντας ισχυρούς αναστολείς της δραστηριότητας RNase. Σε αυτή την περίπτωση, είναι δυνατό να ληφθούν αντίγραφα DNA πλήρους μήκους μορίων RNA στόχου. Μετά τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου DNA στο mRNA και την καταστροφή του RNA (συνήθως χρησιμοποιείται επεξεργασία με αλκάλια), πραγματοποιείται η σύνθεση του δεύτερου κλώνου DNA. Σε αυτή την περίπτωση, χρησιμοποιείται η ικανότητα της ρεβερσετάσης να σχηματίζει αυτοσυμπληρωματικές φουρκέτες στα άκρα 3" των μονόκλωνων cDNA, τα οποία μπορούν να χρησιμεύσουν ως εκκινητής.

Το πρότυπο είναι ο πρώτος κλώνος του cDNA. Αυτή η αντίδραση μπορεί να καταλυθεί είτε από την αντίστροφηάση είτε από την DNA πολυμεράση Ι του Ε. coli. Έχει αποδειχθεί ότι ο συνδυασμός αυτών των δύο ενζύμων καθιστά δυνατή την αύξηση της απόδοσης πλήρων δίκλωνων μορίων cDNA. Στο τέλος της σύνθεσης, ο πρώτος και ο δεύτερος κλώνος του cDNA παραμένουν ομοιοπολικά συνδεδεμένοι με τον βρόχο φουρκέτας που χρησίμευε ως εκκινητής κατά τη σύνθεση του δεύτερου κλώνου. Αυτός ο βρόχος διασπάται από την ενδονουκλεάση S1, η οποία καταστρέφει ειδικά τις μονόκλωνες περιοχές νουκλεϊκά οξέα. Τα άκρα που σχηματίζονται σε αυτή την περίπτωση δεν είναι πάντα αμβλεία και για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της επακόλουθης κλωνοποίησης επιδιορθώνονται για να αμβλύνουν χρησιμοποιώντας το θραύσμα Klenow της πολυμεράσης Ι DNA του E. coli. Το προκύπτον δίκλωνο cDNA μπορεί στη συνέχεια να εισαχθεί σε φορείς κλωνοποίησης, να διαδοθεί ως μέρος μορίων υβριδικού DNA και να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω έρευνα.

1) DNA πολυμεράση, η οποία χρησιμοποιεί και RNA και DNA ως πρότυπο.

2) τη δράση της RNase Η, η οποία υδρολύει το RNA ως μέρος ενός υβριδίου RNA-DNA.

3) Δραστικότητα ενδονουκλεάσης DNA.

Ρύζι. 11. Σχέδιο για τη σύνθεση αντιγράφων δίκλωνου DNA μορίων RNA

Το πρότυπο είναι ο πρώτος κλώνος του cDNA. Αυτή η αντίδραση μπορεί να καταλυθεί είτε από την αντίστροφηάση είτε από την DNA πολυμεράση Ι του Ε. coli. Έχει αποδειχθεί ότι ο συνδυασμός αυτών των δύο ενζύμων καθιστά δυνατή την αύξηση της απόδοσης πλήρων δίκλωνων μορίων cDNA. Στο τέλος της σύνθεσης, ο πρώτος και ο δεύτερος κλώνος του cDNA παραμένουν ομοιοπολικά συνδεδεμένοι με τον βρόχο φουρκέτας που χρησίμευε ως εκκινητής κατά τη σύνθεση του δεύτερου κλώνου. Αυτός ο βρόχος διασπάται από την ενδονουκλεάση S1, η οποία καταστρέφει ειδικά μονόκλωνα τμήματα νουκλεϊκών οξέων. Τα άκρα που σχηματίζονται σε αυτή την περίπτωση δεν είναι πάντα αμβλεία και για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της επακόλουθης κλωνοποίησης επιδιορθώνονται για να αμβλύνουν χρησιμοποιώντας το θραύσμα Klenow της πολυμεράσης Ι DNA του E. coli. Το προκύπτον δίκλωνο cDNA μπορεί στη συνέχεια να εισαχθεί σε φορείς κλωνοποίησης, να διαδοθεί ως μέρος μορίων υβριδικού DNA και να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω έρευνα.